何念武，李丹

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛，726000)

茶葉Camellia sinensis(L.)O.Kuntze為雙子葉植物綱山茶屬植物茶樹的新鮮嫩葉炮制而成，唐代陳藏器在《本草拾遺》中提到:“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥”，說明茶最初是作為藥物來使用的，正如宋代林洪撰的《山家清供》中亦有“茶，即藥也”的論斷一樣，這些都足以證明茶葉有著重要的藥用價(jià)值［1］?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，茶葉富含多種生物活性成分，諸如茶多酚、茶多糖、咖啡堿、氨基酸、維生素等等［2-3］。醫(yī)學(xué)營養(yǎng)學(xué)研究表明，綠茶具有廣泛的藥理活性，諸如抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖及防治心腦血管疾病等功效［5］。由于茶葉中含有大量茶多酚具有很強(qiáng)的抗氧化活性，是人體自由基的天然清除劑，可以有效阻斷亞硝酸胺等多種致癌物質(zhì)在體內(nèi)的合成［6］。同時(shí)，它還能吸收放射性物質(zhì)以達(dá)到防輻射的效果，從而保護(hù)女性皮膚［7］。目前，有關(guān)茶多酚藥理作用的研究已有很多［5］。然而，對其另外一種活性成分茶多糖的研究則遠(yuǎn)比不上茶多酚，再加上多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分離純化難度大等制約因素，從而使得多糖結(jié)構(gòu)與活性研究成為了熱點(diǎn)［8］。

商洛綠茶因所處的獨(dú)特地理位置造就了其色香、味濃、耐沖泡的優(yōu)良品質(zhì)，當(dāng)前商洛茶葉正處于蓬勃發(fā)展之中，如何從科學(xué)的角度去闡述商洛綠茶的藥用價(jià)值或營養(yǎng)價(jià)值就顯得非常重要。為此，本文就商洛綠茶茶多糖分離純化及其體外活性加以探討，以期為深度開發(fā)商洛綠茶的藥用和營養(yǎng)保健價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

商洛綠茶，于2014年6月采自陜西省商洛市商南縣茶園，經(jīng)商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院王新軍教授鑒定為山茶科山茶屬植物茶樹的新鮮嫩葉。

氮藍(lán)四唑(NBT)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;抗壞血酸(VC)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司;1.1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、碘化丙啶(PI)、還原型輔酶(NADH)、吩嗪甲硫酸鹽(PMS)、二甲亞砜(DMSO)、BHT(二丁基羥基甲苯)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、2，2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)、無DNA酶活性的 RNA酶，均購于 Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA);RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液，購自GIBCO公司(Grand Island，USA);胎牛血清(FBS)，購于杭州四季青生物公司;其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.1.2 儀器

可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;FA1104型電子天平，上海精科天平廠;CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司;電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RT6000酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;高壓滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;TGL-20bR高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 商洛綠茶多糖(SGTPs)的分離純化

商洛綠茶粗多糖的制備參照何念武［8］的方法進(jìn)行，以熱水浸提-乙醇沉淀法制得。稱取一定量的粗多糖樣品，溶解后過DEAE-52纖維素柱層析，收集不同的茶多糖組分，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量［9-10］。

1.2.2 不同組分的商洛綠茶多糖體外抗氧化活性

參照 Tian［11］，He［12］等方法并加以適當(dāng)改進(jìn)，分別在DPPH自由基，超氧陰離子，羥基自由基和ABTS自由基體系上檢測不同組分茶多糖的體外抗氧化活性。將不同組分的樣品多糖和BHT分別用蒸餾水配制成1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mg/mL 的劑量，然后在上述抗氧化體系上進(jìn)行檢測，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

(1)DPPH自由基:精確吸取不同濃度的茶多糖樣品和BHT溶液各1 mL置于10 mL刻度離心管中，然后加入0.08 mmol/L的DPPH溶液(乙醇為溶劑)3 mL，室溫，避光反應(yīng)25 min，最后于517 nm測其吸光度值，按照下述公式計(jì)算清除率:

IR/%= ［(Ai-Ab)/Aj］× 100

其中，Ai為樣品吸光值(多糖樣品 +DPPH);Aj為陰性對照(DPPH+樣品溶劑);Ab為樣品本底吸光值(樣品 +溶解DPPH的溶劑)。

(2)超氧陰離子:量取不同濃度的茶多糖樣品和BHT溶液各1 mL置于10 mL刻度離心管中，然后加入0.08 mol/L的NBT水溶液1 mL，再加入1 mL的NADH水溶液(濃度為0.5 mol/L)，最后加入0.5 mL的PMS水溶液，室溫下?lián)u勻、反應(yīng)10 min，而后于560 nm測其吸光度值，按照下述公式計(jì)算清除率:

IR/%= ［(Ai-Ab)/Aj］× 100

其中，Ai為樣品吸光值(多糖樣品 +NBT+NADH+PMS);Aj為陰性對照(NBT+NADH+PMS+樣品溶劑);Ab為樣品本底吸光值(樣品 +蒸餾水)。

(3)羥基自由基:參照 Tian［11］，He［12］等方法進(jìn)行。

(4)ABTS自由基:①ABTS自由基的制備:7 mmol/L的ABTS水溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合;②取不同濃度的茶多糖樣品和BHT溶液各0.5 mL加入含有3.5 mL的ABTS自由基溶液的離心管中，室溫、靜置10 min，最后于734 nm測其吸光度值，按照下述公式計(jì)算清除率:

IR/%= ［1-(Ai-A0)/Aj］× 100

其中，Ai為樣品吸光值(多糖樣品 +ABTS);Aj為陰性對照(ABTS+樣品溶劑);A0為樣品本底吸光值(樣品+溶解ABTS的溶劑)。

1.2.3 不同組分的SGTPs對乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的生長抑制作用

在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞模型上，以MTT法篩選具有抑制 MCF-7細(xì)胞生長的活性多糖組分［12-14］。具體而言，取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并調(diào)濃度至5×104～1×105個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔加90 μL，置37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入10 μL用生理鹽水配制而成的不同濃度(0.0、50.0、150.0、200.0 μg/mL)的茶多糖樣品溶液，以5-氟尿嘧啶(5-Fu)為陽性對照，生理鹽水和培養(yǎng)液作為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)44 h，加入20 μL MTT(5 mg/mL)，4 h后加入SDS三聯(lián)液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)分析儀570 nm處測定吸光值，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率:

2 結(jié)果與分析

2.1 商洛綠茶多糖的分離純化

如圖1所示為SGTPs經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離后的結(jié)果。洗脫液分別采用0.05、0.15、0.45 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得到3個(gè)單一的洗脫峰。將收集到的 0.05、0.15、0.45 mol/L NaCl洗脫液洗脫部位，減壓蒸餾，透析(分子截留量8 000 Da)3 d，每天換6次水，冷凍干燥，得到SGTPs-1、SGTPs-2、SGTPs-3三個(gè)組分。經(jīng)測定3個(gè)組分的總糖含量分別為83.5%，76.8%，89.7%。

圖1 SGTPs的DEAE纖維素柱色譜圖Fig.1 Eluting curve of SGTPs on DEAE-52 column

2.2 SGTPs對DPPH自由基的清除能力

從圖2中可以看出，SGTPs不同組分對DPPH自由基的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而逐步增加，并且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。尤其是在高濃度的時(shí)候，樣品對DPPH自由基的清除率越接近相同劑量的陽性對照。另外，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，SGTPs-2對DPPH自由基的清除能力最弱，SGTPs-3的清除能力最強(qiáng)，SGTPs-1介于二者之間，這可能是因?yàn)槠涠嗵呛扛鳟惖木壒省?/p>

圖2 SGTPs對DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of SGTPs

2.3 SGTPs對超氧陰離子的清除作用

由圖3中可以看出，SGTPs不同組分對超氧陰離子自由基的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)較為緩慢的增加，但依然呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。另外，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，SGTPs-2對DPPH自由基的清除能力最弱，SGTPs-3的清除能力最強(qiáng)，SGTPs-1介于二者之間。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，SGTPs-1、SGTPs-2和SGTPs-3對超氧陰離子的清除率分別為52.4%，46.3%，63.7%，而此時(shí)相同劑量的陽性對照清除率為100%。由此可見，SGTPs不同組分對超氧陰離子自由基的清除能力要比同劑量的陽性對照低的多。眾所周知，每個(gè)人體內(nèi)都有一定數(shù)量的超氧陰離子存在，如若不發(fā)生化學(xué)變化則對人體無害，但是受到外界刺激或是與羥基結(jié)合后的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，破壞機(jī)體功能。研究表明，一定量的SGTPs能夠起到清除超氧陰離子的效果，由此推測長期飲茶可以起到預(yù)防超氧陰離子對機(jī)體造成的損傷。

2.4 SGTPs對羥基自由基的清除作用

從下圖4中可以看出，SGTPs不同組分對羥基自由基的清除率隨著劑量不斷增加幾乎呈線性遞增的趨勢。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度從1.0 mg/mL增加到4.0 mg/mL的時(shí)候，SGTPs-3對羥基自由基的清除率依次為13.6%，24.5%，35.8%，43.7%，49.4%，55.5%，61.2%;SGTPs-1對羥基自由基的清除率則從8.5%上升到58.3%;而SGTPs-2對羥基自由基的清除率增長最為緩慢，亦是3個(gè)組分中清除率最低的一個(gè)組分，由此可見這與其多糖含量最低是分不開的。

圖3 SGTPs對超氧陰離子的清除率Fig.3 Superoxide radical scavenging activity of SGTPs

圖4 SGTPs對羥基自由基的清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of SGTPs

2.5 SGTPs對ABTS自由基的清除作用

從圖5中可以看出，隨著質(zhì)量濃度的不斷遞增，SGTPs不同組分對ABTS自由基的清除率逐漸增加，而且呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。尤其是當(dāng)濃度為4.0 mg/mL時(shí)，樣品對DPPH自由基的清除率接近相同劑量的陽性對照，SGTPs-1，SGTPs-2，SGTPs-3以及BHT對 ABTS自由基的清除率依次為80.4%，75.7%，85.8%和100%。另外，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，SGTPs三個(gè)組分對ABTS自由基的清除率順序仍然是SGTPs-3＞SGTPs-1＞SGTPs-1。SGTPs-2仍然是活性最弱的。

圖5 SGTPs對ABTS自由基的清除率Fig.5 ABTS radical scavenging activity of SGTPs

2.6 SGTPs不同組分對不同自由基體系的半數(shù)有效濃度(EC50)

半數(shù)有效濃度(EC50)，即能引起50%陽性反應(yīng)(質(zhì)反應(yīng))或50%最大效應(yīng)(量效應(yīng))的濃度。半數(shù)有效濃度可快速地判斷被試物質(zhì)對反應(yīng)體系可能產(chǎn)生的影響或效果，為進(jìn)一步作慢性毒性研究提供依據(jù)。從下表1中可以看出，SGTPs各組分對不同自由基的EC50差異較大，有的組分與陽性對照差距比較小，而有的組分差距較大。其中，3個(gè)組分當(dāng)中SGTPs-3的EC50相比之下是最小的，SGTPs-2則是最大的。另外，從中也可以看出，SGTPs對ABTS自由基的清除作用最好，其次是DPPH自由基，最后是超氧陰離子和羥基自由基?？傮w而言，3個(gè)組分總的抗氧化能力順序依次為SGTPs-3＞ SGTPs-1＞SGTPs-2。

表1 SGTPs對各自由基體系的EC50 單位:mg/mLTable 1 The free radical system EC50 of SGTPs

2.7 SGTPs不同組分對MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用

從圖6中可以看出，SGTPs不同組分對MCF-7細(xì)胞均有不同程度生長抑制作用，并且呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。而且當(dāng) SGTPs濃度在200 μg/mL時(shí)，SGTPs-1的抑制率為51.29%，SGTPs-2的抑制率為48.63%，SGTPs-3的抑制率為61.83%，而此濃度下陽性藥物的抑制率為70.71%。另外，3個(gè)組分的半數(shù)抑制濃度(IC50)依次為 206.55，227.91，157.06 μg/mL，而陽性對照的則是110.64 μg/mL，結(jié)果表明SGTPs-3對MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用最強(qiáng)。同時(shí)，在相同時(shí)間、相同劑量的條件下，SGTPs處理后細(xì)胞的生長抑制率接近于同濃度的陽性藥物(5-FU)，說明商洛綠茶茶多糖對MCF-7細(xì)胞又較好的生長抑制作用。

3 結(jié)論

(1)通過熱水浸提-乙醇沉淀法制備的粗多糖，經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析純化后得到SGTPs-1，SGTPs-2，SGTPs-3三個(gè)組分，多糖含量分別為83.5%，76.8%，89.7%。

圖6 SGTPs不同組分對MCF-7細(xì)胞的抑制率Fig.6 The different fractions of SGTPs on the inhibition rate of MCF-7 cells

(2)SGTPs對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和超氧陰離子均有不同程度的清除能力，其中對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)，對另外兩種自由基清除能力相對較弱。總體而言，商洛綠茶多糖3個(gè)組分對不同自由基的清除能力均呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，其中SGTPs-3組分的作用最強(qiáng)，其次為SGTPs-1，最后是SGTPs-2。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，SGTPs-3對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基和超氧陰離子的清除率分別為85.4%，85.8%，61.2%和63.7%。

(3)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用研究結(jié)果表明，SGTPs3個(gè)組分對MCF-7細(xì)胞均有一定的生長抑制作用，且伴隨著質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)遞增趨勢。在濃度為200 μg/mL時(shí)，SGTPs三個(gè)組分的生長抑制率分別為51.29%，48.63%和61.83%。

［1］ 何念武.紫陽富硒綠茶茶多糖與茶多酚抗腫瘤藥理作用研究［D］.西安:陜西師范大學(xué)，2012:1-2.

［2］ 劉爽.綠茶鮮爽味的化學(xué)成分及判別模型研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014:2-5.

［3］ 魏威.綠茶化學(xué)成分及其抗氧化活性的研究［D］.大連:遼寧師范大學(xué)，2010:4-6.

［4］ 師少軍，陳華庭，曾繁典.綠茶的藥理作用與臨床應(yīng)用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(8):692-696.

［5］ 李軍，辛勤，楊雁.綠茶多酚藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14(1):128-130.

［6］ 趙保路.茶多酚的抗氧化作用［J］.科學(xué)通報(bào)，2002，47(16):1 206-1 210.

［7］ 吳亮宇，林金科.茶多酚抗輻射研究進(jìn)展［J］.茶葉，2011，37(4):213-217.

［8］ 何念武.水提醇沉法制備商南泉茗茶茶多糖的研究［J］.商洛學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，27(6):78-81.

［9］ 張倩，張民，王超，等.枸杞多糖分離純化及結(jié)構(gòu)研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(12):41-47.

［10］ 楊紅燕，嚴(yán)楠楠，姜艷紅，等.苦蕎茶多糖的體外抗氧化活性及其分離純化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(12):94-99.

［11］ TIAN Lingmin，ZHAO Yan，GUO Chao，et al.A comparative study on the antioxidant activities of an acidic polysaccharide and various solvent extracts derived from herbal Houttuynia cordata［J］.Carbohydrate Polymers，2011，83(2):537-544.

［12］ HE Nianwu，YANG Xingbin，JIAO Yadong，et al.Characterisation of antioxidant and antiproliferative acidic polysaccharides from Chinese wolfberry fruits［J］.Food Chemistry，2012，133(3):978-989.

［13］ HE Nianwu，SHI Xiaolong，ZHAO Yan，et al.Inhibitory effects and molecular mechanisms of selenium-containing tea polysaccharides on human breast cancer MCF-7 Cells［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61(3):579-588.

［14］ ZHANG Haisheng，ZHANG Min，YU Linhong，et al.Antitumor activities of quercetin and quercetin-5，8-disulfonate in human colon and breast cancer cell lines［J］.Food and Chemical Toxicology，2012，50(5):1 589-1 599.