高磊，謝晶，葉藻，張寧，汪逸麟，高忱岳陽

(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)

2011年，中國肉雞產品的總消費量是1 365.6萬t，占世界比重的16.35%，成為僅次于豬肉的第二大肉類消費品［1］。近年來，動物性流感H7N9的爆發(fā)［2］致使中國雞肉消費結構發(fā)生了明顯變化，活禽市場備受質疑，消費者逐漸開始選擇購買冷鮮雞。但雞經屠宰、加工、運輸后，在冷藏過程中由于細菌的大量生長繁殖，會導致雞肉品質劣化，從而限制了冷鮮雞的貨架期。已有大量研究表明，假單胞菌、腸桿菌、熱死環(huán)絲菌、乳酸菌和不動桿菌等是導致冷鮮肉腐敗的主要微生物［3-6］。這些較其他微生物生長更快、腐敗能力更強的微生物被稱為優(yōu)勢腐敗菌［7］，是對食品腐敗變質起主導作用的細菌。因此，研究冷鮮雞中優(yōu)勢腐敗菌的特性對于冷鮮雞的保鮮具有重要意義。

本實驗選用冷藏變質的冷鮮雞，以其腿肉為研究對象，先采用平板劃線分離和感官評價方法對冷鮮雞腿肉中的優(yōu)勢腐敗菌進行分離篩選，再根據菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生理生化實驗以及16S rDNA序列分析對菌株進行鑒定。最后，重新將其接種至滅菌肉塊，且以TVB-N產量因子Y(TVB-N/CFU)作為各優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的定量指標，進一步研究優(yōu)勢腐敗菌的腐敗特性。

1 材料與方法

1.1 原料

實驗所用冷鮮雞購于上海農工商超市(臨港新城店)冷鮮肉專柜，經8天冷藏變質后取腿肉。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、VRBDA-腸道菌瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、STAA培養(yǎng)基、MSA-甘露醇高鹽瓊脂、精氨酸水解酶培養(yǎng)基、葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基:青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

瓊脂糖、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、用于PCR擴增的全套試劑及合成的擴增引物，生工生物工程(上海)股份有限公司;1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液、3%H2O2，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司;NaCl、MgO、H3BO3、HCl(均為分析純)，國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.3 儀器與設備

LDZX-50KE高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;VS-1300L-U潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;PowerPac Basic電泳儀、Universal Hood II凝膠成像儀，BIO-RAD公司;Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司;Mastercycler6325 PCR擴增儀、5427R離心機，EPPENDORF公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 腐敗菌的分離純化

在無菌環(huán)境下從變質的冷鮮雞中隨機取10 g雞腿肉，用無菌剪刀剪碎，加到90 mL無菌生理鹽水中，封口后振蕩30 min，取上清液1 mL進行10倍梯度稀釋，選擇3個合適的稀釋度，每個稀釋度做3次重復，傾注于含有不同選擇培養(yǎng)基的平板中，培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件見表1。

表1 各菌的選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Culture media and conditions of different bacteria

從上述不同選擇培養(yǎng)基的平板中，挑取各種典型生長的菌落，然后在各自的培養(yǎng)基上反復進行平板劃線分離，得到純化的單菌落［8］，最后于斜面培養(yǎng)基保存。

1.4.2 優(yōu)勢腐敗菌的篩選

將分離純化的各菌株重新培養(yǎng)至對數期后，用無菌生理鹽水制成菌懸液［9］，搖勻，利用血球計數板直接測定菌液濃度［10］，調整菌液濃度為105～106CFU/mL。用無菌剪刀將冷鮮雞腿肉分割成30 g左右大小均勻的肉塊后，先將75%酒精噴在其表面，靜置10 s后用無菌水沖洗，再在超凈臺上用酒精燈對其進行表面滅菌，然后浸泡于調整過的菌液30 s后取出放入無菌自封袋中，每種菌株接種2個肉塊，以2個未接種過的肉塊作對照于4℃下貯藏。根據肉塊的色澤、黏度、彈性和氣味，每天進行感官評價［11-12］，將腐敗最快的肉塊所接種的菌株作為篩選出的優(yōu)勢腐敗菌，對其進行菌種鑒定并測定該菌對冷鮮雞腿肉的腐敗能力。

1.4.3 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

1.4.3.1 觀察菌落特征和菌體形態(tài)

菌落特征:菌落大小(細如針尖、小、中等、大);質地(堅硬、干燥、濕潤);邊緣形狀(整齊、星狀、楓葉狀、樹葉狀等);光滑程度(粗糙、光滑、黏液型);透明度(透明、半透明、不透明);菌落顏色。

通過革蘭氏染色、鞭毛染色及芽孢染色，對重新培養(yǎng)18～24 h長勢好的單菌落進行顯微鏡觀察。菌體形態(tài):細胞形態(tài)(短桿、長桿及球狀等);革蘭氏染色分陰性和陽性;鞭毛的著生部位(周生、側生和端生);芽孢的生長位置和情況。

1.4.3.2 生理生化試驗

根據《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］和《伯杰細菌鑒定手冊》［14］對各菌株進行氧化酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化發(fā)酵(O/F)和精氨酸雙水解酶實驗。

1.4.3.3 DNA的提取

挑取重新培養(yǎng)18～24 h的單菌落至液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，采用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒直接提取DNA，提取的DNA作為該菌株的擴增模板，于-20℃保存待下一步實驗。

1.4.3.4 16S rDNA的PCR擴增

以提取的DNA作為模板，采用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)來擴增目的片段的基因［15］。采用25 μL體系進行 PCR擴增，即 Taq PCR Master Mix(2 × )12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、27F 上游引物和1492R下游引物各1 μL及模板 DNA 1 μL。PCR擴增程序［15］為:94℃預變性4 min;94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，進行35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。用1×TAE緩沖液配制2%瓊脂糖凝膠，取3 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，再用溴化乙錠(EB)對其染色后，在凝膠成像儀中觀察電泳結果并拍攝電泳圖譜，每種菌株均獲得長度為1500 bp左右的條帶，最后將PCR擴增產物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4.3.5 DNA測序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

登陸網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，將測序所得16S rDNA序列與核酸序列數據庫中已知序列進行同源比對，從中選取若干個相似性高的菌株序列，使用MEGA6.06軟件，通過鄰接法(Neighbor-Joining)做1 000次隨機抽樣構建系統(tǒng)發(fā)育樹［16］。

1.4.4 優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的測定

將篩選所得的優(yōu)勢腐敗菌按照1.4.2節(jié)的方法制得一定濃度的菌懸液，接種于滅菌的肉塊后放入無菌自封袋中4 ℃貯藏。在第1、2、4、6、8天時，以未接種過的肉塊作對照，每組各取2個肉塊測定菌落總數［17］和揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)［18］。將 TVB-N 產量因子Y(TVB-N/CFU)作為各優(yōu)勢腐敗菌腐敗能力的定量指標［19］，公式如下:

1.4.5 數據分析

序列拼接采用DNASIS 3.0;DNA序列的分析，同源性比較用ClUSTAL W 2.0.10;系統(tǒng)發(fā)育樹的構建用MEGA 6.06軟件。數據采用3次平行試驗的平均值，結果用平均值和標準偏差表示;曲線采用OriginPro 9.0繪制;利用SPSS 19.0進行差異顯著性分析，P＜0.05表示顯著差異。

2 結果與討論

2.1 優(yōu)勢腐敗菌的篩選

將變質冷鮮雞腿肉的稀釋液傾注于含有不同選擇培養(yǎng)基的平板，從中挑取典型生長的菌落共17株。其中在假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基中挑了6株、VRBDA培養(yǎng)基4株、MSA培養(yǎng)基3株、STAA培養(yǎng)基4株、MRS培養(yǎng)基0株。經反復劃線分離純化后制成一定濃度的菌懸液，接種至新鮮的冷鮮雞腿肉。每天進行感官評價，感官可接受性逐漸降低，發(fā)現經菌株J3、S1、M3、V1、J1接種過的肉塊感官得分最低，腐敗較快。其中J3和J1源自假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基、S1源自STAA培養(yǎng)基、M3源自MSA培養(yǎng)基、V1源自VRBDA培養(yǎng)基。第4天開始，表面無光澤，外表濕潤不粘手，肌肉稍有彈性，略有異味;到第7天，色澤暗淡呈褐色，外表濕潤沾手，肌肉失去彈性，異味較強，肉塊已明顯腐敗。不同的細菌分解利用糖類、脂肪類和蛋白質類物質的能力不同，因此其代謝產物和腐敗能力也不同。因此，對篩選出的5 株優(yōu)勢腐敗菌 J3、S1、M3、V1、J1，進行菌種鑒定并測定該菌對冷鮮雞腿肉的腐敗能力。

2.2 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

2.2.1 菌落特征和菌體形態(tài)

通過革蘭氏染色后鏡檢，觀察各菌體的形態(tài)結構及其在固體培養(yǎng)基上的菌落特征，結果見表2。

表2 菌落特征以及菌體形態(tài)Table 2 Characteristics of bacterial colony and shape of strains

2.2.2 生理生化實驗

根據食品微生物鑒定圖譜以及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］，通過鏡檢各種菌在顯微鏡下的菌體形態(tài)、革蘭氏染色情況等，結合表3的生理生化實驗結果，初步鑒定J3為假單胞菌屬，S1為環(huán)絲菌屬，M3為葡萄球菌屬，V1為無色桿菌屬，J1為腸桿菌科。

表3 生理生化實驗結果Table 3 Physiological characteristics of spoilage bacteria

2.2.3 優(yōu)勢腐敗菌16S rDNA的PCR擴增

分別提取5株菌的基因組DNA后，以其總DNA為模板利用PCR擴增其16S rDNA基因片段。結果如圖1所示，5個樣品均獲長度在1 500 bp左右的條帶，最后將PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

圖1 菌株的16S rDNA PCR電泳圖譜Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA genes

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將測序所得16S rDNA序列與核酸序列數據庫中已知序列進行比對，選取相似性高的菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如圖2所示。不難發(fā)現:J1與沙雷氏菌屬的Serratia grimesii同源性最高;J3與假單胞菌屬的Pseudomonas pseudoalcaligenes同源性最高;M3與葡萄球菌屬的Staphylococcus saprophyticus同源性最高;V1與無色桿菌屬的Achromobacter xylosoxidans同源性最高;S1與環(huán)絲菌屬中的 Brochothrix thermosphacta同源性最高。Pseudomonas pseudoalcaligenes屬于假單胞菌屬，是食品典型腐敗菌。雞肉在冷藏過程中，它由于更加適應低溫的環(huán)境，在肉類上極易繁殖，且具有很強的產生氨等腐敗產物的能力，是冷藏畜肉中存在的優(yōu)勢菌［4，20］。Serratia grimesii屬沙雷氏菌屬，它是革蘭氏陰性菌并兼性厭氧。主要利用該菌中酶對自由氨基酸發(fā)生脫羧基作用而形成生物胺［21］。當人體攝入過量生物胺時，可引起疾病(如頭痛、傷寒、肺炎、腸炎等)，它也有一定的食物中毒危險性，因此應嚴格控制Serratia grimesii的生長繁殖。Staphylococcus saprophyticus是葡萄球菌屬的一種，在自然界中分布很廣，是常見的腐敗菌。該菌主要起源于禽類本身［22］，但在加工、運輸等過程中繁殖機會大大增加。Achromobacter xylosoxidans屬于無色桿菌屬，廣泛分布在水和土壤中。雞肉表面發(fā)黏，是由于無色桿菌在肉的表面生長繁殖，產生黏液的結果。在冷藏溫度和高濕度下有利于其生長。同時，無色桿菌也能分解冷鮮雞中的某些脂肪而加速脂肪的氧化作用，引起肉類酸敗。Brochothrix thermosphacta是革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在4℃下能較快地生長，被認為是冷藏溫度下引起冷卻肉腐敗變質的主要微生物之一［3，23］。在有氧條件下，較高數量的熱死環(huán)絲菌會產生乙偶姻、雙乙酰、甲基丁醇等令人不愉快的揮發(fā)性代謝產物［24］。這些分離出的腐敗菌是冷鮮雞中常見腐敗菌，它們主要是由于雞在屠宰、運輸和銷售和包裝過程中污染，且在冷藏過程仍有殘存且大量繁殖，導致冷鮮雞最終腐敗變質。冷鮮雞中的優(yōu)勢腐敗菌相對于冷卻豬肉來說，情況基本一致，但乳酸菌、不動桿菌以及莫拉氏菌等常見冷卻肉腐敗菌并未檢出，或其對雞肉的腐敗能力不強。

圖2 基于16S rDNA序列同源性的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹圖Fig.2 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA sequences

2.3 接種肉塊的菌落總數和TVB-N變化

將篩選所得5株優(yōu)勢腐敗菌重新接種至滅菌的肉塊于4 ℃貯藏，分別在第1、2、4、6、8 天時，以未接種過的肉塊作對照(CK)，每組各取2個肉塊測定菌落總數和TVB-N變化，結果見圖3和圖4。

肉類食品的腐敗變質是由肉中的酶以及微生物的作用，使蛋白質分解，脂肪氧化而引起的，微生物的大量繁殖是造成肉類食品腐敗的主要根源。因此，肉中菌落總數是表示肉品腐敗程度的一個重要指標。圖3所示，在整個4℃貯藏過程中，接種肉塊和對照組中的菌落總數呈總體增長趨勢，且接種肉塊的菌落總數均高于對照組。其中，接種假單胞菌的肉塊菌落總數增長速度較快，其他4株腐敗菌也有不同程度的增長。在貯藏末期，也達到了較高的對數值，各接種塊的菌落總數均超過9.1(lg(CFU/g))，與對照組8.3(lg(CFU/g))有顯著差異(P＜0.05)。貯藏前5天，菌落總數增長明顯，5天后開始進入穩(wěn)定期。以上現象表明:食品原有的嗜冷菌在低溫貯藏期間，會利用蛋白質和營養(yǎng)物質良好地生長，菌落總數急劇增加，且優(yōu)勢腐敗菌的存在會進一步加速冷鮮肉腐敗現象的產生。但微生物因生長環(huán)境變差(代謝產物積累、排出毒素、營養(yǎng)缺乏等)生長緩慢從而進入穩(wěn)定期。

圖3 接種優(yōu)勢腐敗菌的滅菌肉塊在4℃貯藏菌落總數的變化Fig.3 Microbial counts change of sterile chicken blocks inoculated with dominant spoilage bacteria stored at 4℃

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是指肉及肉制品水浸液在堿性條件下能與水蒸氣一起蒸餾出來的總氮量，是評價肉及其制品新鮮度的一項重要指標。它是由于微生物的繁殖使其進入肉的深層組織，從而引起的脫羧、脫氨作用導致蛋白質的分解而形成的產物。在冷鮮雞中分解游離出的鹽基氮類物質主要有:伯胺、仲胺、叔胺包括尸胺、腐胺、酪胺、精胺、氨等［25］。評價標準［26］為:一級鮮度≤15 mg/100 g，二級鮮度(可食范圍)≤25 mg/100 g，變質肉 ＞25 mg/100 g。在4℃貯藏期間，接種優(yōu)勢腐敗菌的滅菌肉塊TVB-N的變化如圖4所示，接種腐敗菌的肉塊在4℃貯藏期間TVB-N值逐漸增大，貯藏初期，TVB-N值變化不明顯。但到了第5天，隨著腐敗菌的生長繁殖各組肉塊的TVB-N值明顯增加，且均超過了15 mg/100 g，已超過一級鮮度，肉品開始腐敗變質。到了貯藏末期，各組肉塊的TVB-N值均超過24 mg/100 g，肉質基本達到腐敗程度。其中J3組的TVB-N值高達37.89 mg/100 g，其次是 J1組35.47 mg/100 g，而 V1組的TVB-N值25.75 mg/100 g略高于對照組的24.84 mg/100 g，表明 V1(Achromobacter xylosoxidans)分解肉中蛋白質加速其氧化作用不大，腐敗能力較弱，而J3(Pseudomonas pseudoalcaligenes)利用肉中營養(yǎng)物質產生較多代謝產物，腐敗能力強。因此，除了V1組，接種過腐敗菌的各組肉塊TVB-N值與對照組有顯著差異(P＜0.05)，說明腐敗菌的生長繁殖是導致TVB-N產生的主要原因。

圖4 接種優(yōu)勢腐敗菌的滅菌肉塊在4℃貯藏TVB-N的變化Fig.4 Total volatile base nitrogen change of sterile fish blocks inoculated with spoilage bacteria stored at 4℃

2.4 優(yōu)勢腐敗菌的腐敗能力分析

本研究通過計算將TVB-N值與菌落總數結合，用TVB-N產量因子Y(TVB-N/CFU)定量表示各腐敗菌的腐敗能力［23］。由表4可知，接種腐敗菌 J3(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的 YTVB-N值最大2.06/(10-8mg TVB-N/CFU)，明顯高于其他4株，而接種腐敗菌V1(Achromobacter xylosoxidans)YTVB-N值最小0.91/(10-8mg TVB-N/CFU)。

表4 各種優(yōu)勢腐敗菌的TVB-N產量因子Table 4 Yield factor of TVB-N of dominant spoilage bacteria

腐敗菌的腐敗能力差異源自其利用肉中營養(yǎng)物質產生代謝產物的能力不同。結果表明，在4℃貯藏期間，腐敗菌J3對冷鮮雞腿肉的腐敗能力較強，其次是J1(Serratia grimesii)和 M3(Staphylococcus saprophyticus)，而V1和S1(Brochothrix thermosphacta)腐敗能力相對較弱。該結果可為今后針對性地選擇保鮮劑保鮮冷鮮雞提供一定理論依據。

3 結論

實驗從變質冷鮮雞的腿肉中分離并通過感官評價篩得5株優(yōu)勢腐敗菌，經菌落特征、菌體形態(tài)、生理生化實驗以及16S rDNA 序列分析，J3、S1、M3、V1、J1分別鑒定為:Pseudomonas pseudoalcaligenes、Brochothrix thermosphacta、Staphylococcus saprophyticus、Achromobacter xylosoxidans、Serratia grimesii。進一步研究表明，J3對冷鮮雞腿肉的腐敗能力較強，其次是J1和M3，而V1和S1的腐敗能力相對較弱。

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