劉丹，吳玉環(huán)，沈洋，潘少安，張露軍，曹林，馬麗，酈楓，章藝，徐根娣，劉鵬*

1. 浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所，浙江 金華 321004；2. 浙江師范大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004；3. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 330036；4. 杭州旅游職業(yè)學(xué)院，浙江 杭州 311231

外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓抗氧化酶系的影響

劉丹1,2，吳玉環(huán)3，沈洋1，潘少安1，張露軍1，曹林2，馬麗2，酈楓1，章藝4，徐根娣1,2，劉鵬1,2*

1. 浙江師范大學(xué)生態(tài)研究所，浙江 金華 321004；2. 浙江師范大學(xué)植物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004；3. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 330036；4. 杭州旅游職業(yè)學(xué)院，浙江 杭州 311231

在金華地區(qū)選取連作3年的栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）為試驗(yàn)材料，通過(guò)澆灌不同濃度（0，2.5，5，7.5，10 mg·L-1）脫落酸（ABA），在正常連作情況下測(cè)量其葉片的抗氧化酶系活性，探究外源脫落酸緩解栝樓連作障礙的作用機(jī)制，為緩解栝樓連作障礙提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：在正常連作情況下，栝樓幼苗經(jīng)過(guò)外源ABA連續(xù)處理7 d，處理結(jié)束后再過(guò)7 d對(duì)葉片進(jìn)行采樣測(cè)定酶活性，發(fā)現(xiàn)超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化物酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性總體隨處理的外源ABA濃度的升高而呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。除了 PPO酶活性的峰值出現(xiàn)在外源ABA濃度為7.5 mg·L-1外，其余酶的酶活性峰值均出現(xiàn)在5 mg·L-1。在過(guò)高的外源ABA濃度下，SOD、POD、CAT的酶活性出現(xiàn)低于對(duì)照組的現(xiàn)象，推測(cè)過(guò)高濃度的外源ABA可能不利于連作植物生長(zhǎng)。由隸屬函數(shù)分析得出，5 mg·L-1的外源ABA可以有效緩解栝樓的連作障礙。

連作障礙；栝樓；脫落酸；抗氧化酶系

LIU Dan, WU Yuhuan, SHEN Yang, PAN Shaoan, ZHANG Lujun, CAO Lin, MA Li, LI Feng, ZHANG Yi, XU Gendi, LIU Peng. Effect of Exogenous Abscisic Acid on Anti-oxidative Enzymes of Replanted Trichosanthes kirilowii Maxim. [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(12): 1989-1994.

栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim.）也稱(chēng)瓜萎、吊瓜，屬葫蘆科，多年生攀緣草本植物。其根（中藥名天花粉）、果（中藥名栝樓實(shí)）、種子（中藥名栝樓仁）、果皮（中藥名栝樓皮）均可入藥，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗腫瘤、抗?jié)?、抗衰老、抑制血小板凝集等作用（任靜等，2010）。近年來(lái)，有關(guān)栝樓的研究主要側(cè)重于其化學(xué)組分（李?lèi)?ài)峰，2014）、組織培養(yǎng)（錢(qián)驊等，2014）、蛋白提取工藝（熊利芝等，2014）、抗寒性（盧富桃等，2014）、繁殖（楊麗娜等，2008）以及耐鋁性等方面（周媛等，2012），對(duì)栝樓連作障礙的研究目前還沒(méi)有報(bào)道。連作障礙是指在同一片土壤中連續(xù)種植同一種作物或者近緣作物時(shí)，即使在正常的栽培管理?xiàng)l件下，也會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降的現(xiàn)象。連作障礙不僅直接影響農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且還會(huì)影響相關(guān)的加工業(yè)等。同時(shí)，田間濫用化肥農(nóng)藥的做法不但不能緩解連作障礙，反而會(huì)引起土壤質(zhì)量下降，使得作物的產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)一步降低，形成惡性循環(huán)。連作造成的土壤生物退化現(xiàn)象已經(jīng)成為限制現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素（王玲娜，2010）。

脫落酸（Abscisic Acid），最開(kāi)始作為一種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的激素被人們所熟知。隨著人們對(duì)它的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不但可以平衡植物內(nèi)源激素和有關(guān)生長(zhǎng)活性物質(zhì)的代謝，還可以有效激活植物體內(nèi)抗逆免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)植物綜合抗性（抗旱、抗寒。抗熱、抗鹽堿等）的能力，因此，被人們稱(chēng)為“脅迫激素”和“生長(zhǎng)平衡因子”（韓超等，2012）。目前為止，對(duì)脫落酸的研究方向主要有抗寒性（羅立津等，2011）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（吳玲云等，2014）、鎘脅迫（張超，2014）等，國(guó)內(nèi)外有關(guān)栝樓連作障礙的研究工作未見(jiàn)任何報(bào)道，更沒(méi)有涉及到 ABA與緩解連作障礙之間關(guān)系的研究工作的相關(guān)報(bào)道。本文以連作3年的栝樓為試驗(yàn)材料，研究在常溫下經(jīng)過(guò)不同濃度的ABA處理，栝樓葉片內(nèi)抗氧化酶系的變化，來(lái)探討ABA與栝樓連作障礙的關(guān)系，為緩解栝樓連作障礙提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試驗(yàn)材料及處理方法

試驗(yàn)于2014年8月─2015年2月在浙江師范大學(xué)生物園進(jìn)行，以植物基地內(nèi)連續(xù)種植至第3年的栝樓為試驗(yàn)材料。選取生長(zhǎng)狀況一致的，光照條件均等的栝樓成苗，進(jìn)行試驗(yàn)。

將實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行分組：T0組，正常情況下連作3年生長(zhǎng)的植株，每天澆灌蒸餾水于其根部，即對(duì)照組；T1組，澆灌2.5 mg·L-1ABA于其根部處理；T2組，澆灌5 mg·L-1ABA于其根部處理；T3組，澆灌7.5 mg·L-1ABA于其根部處理；T4組，澆灌10 mg·L-1ABA于其根部處理。各組在植株開(kāi)花前連續(xù)澆灌ABA1周，每天每株500 mL，每組3株，澆灌結(jié)束7 d后采取新葉進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.2測(cè)定方法

抗氧化酶系的測(cè)定：超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性的測(cè)定參照高俊鳳（鄒琦，2000）的方法；多酚氧化酶（PPO）參照紫外分光光度計(jì)（中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所和上海市植物生理學(xué)會(huì)，1999）的方法。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理根據(jù)3次獨(dú)立試驗(yàn)所得，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，分析差異顯著性，origin 8.0軟件制圖。

利用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)估，具體方法為：

（1）式、（2）式表示i處理水平下j指標(biāo)的緩解連作障礙的隸屬函數(shù)值，Xij表示i處理水平下 j指標(biāo)的測(cè)定值，Xjmax、Xjmin表示該處理水平下所測(cè)指標(biāo)的最大值和最小值。在計(jì)算各生理指標(biāo)的連作障礙系數(shù)的隸屬函數(shù)值時(shí)，如果緩解連作障礙系數(shù)與連作障礙呈正相關(guān)，則用（1）式計(jì)算；如果連作障礙系數(shù)與連作障礙呈負(fù)相關(guān)，則用（2）式計(jì)算；（3）式表示在i水平下緩解連作障礙隸屬函數(shù)的平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓 SOD活性的影響

由圖1可見(jiàn)，連續(xù)種植至第3年的栝樓經(jīng)過(guò)不同濃度的ABA處理，不同的處理組間，SOD的活性存在顯著性差異，可能與外源ABA和SOD的合成有著直接關(guān)系，外源ABA濃度的變化顯著地影響著SOD的酶活性。T1、T2、T3處理組比T0分別提高了30.06%，161.6%，125.28%，而T4則比T0降低了67.96%。說(shuō)明隨著ABA濃度的增加，SOD活性出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的現(xiàn)象，推測(cè)當(dāng)外源 ABA的濃度超出一定范圍后，會(huì)更加抑制SOD的活性，可能比植株連作障礙所造成的抑制程度更大，以致植株更容易受到外界的傷害。本實(shí)驗(yàn) SOD活性在ABA濃度為5 mg·L-1時(shí)，出現(xiàn)最高值；當(dāng)濃度為7.5 mg·L-1時(shí)，外源ABA仍可以提高SOD活性，只是效果不及濃度為 5 mg·L-1時(shí)。上述情況表明外源ABA與SOD活性變化存在一定關(guān)系，本研究為今后探明外源ABA與SOD活性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

圖1　不同濃度外源ABA處理對(duì)連作障礙下栝樓SOD活性的影響Fig. 1 Effect on SOD activity of Trichosanthes kirilowii different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles

2.2外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓 POD活性的影響

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）對(duì)植物的呼吸作用和光合作用都起到一定的保護(hù)作用，可清除體內(nèi)活性氧（Zhang et al.，2003）。由圖2可知，不同濃度ABA對(duì)連作障礙下栝樓的POD活性，在個(gè)別處理組間存在顯著性差異。處理組T1、T2比處理組T0分別提高了59.34%，126.04%，而T3、T4比處理組T0分別降低了38.57%，51.55%。表明隨著ABA濃度的升高，POD活性呈現(xiàn)明顯的先增強(qiáng)后減弱的現(xiàn)象，峰值出現(xiàn)在ABA濃度為5 mg·L-1時(shí)，但當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，外源ABA不但沒(méi)有緩解連作障礙，反而抑制了POD的活性。據(jù)此我們推測(cè)，在ABA濃度超過(guò)5 mg·L-1時(shí)，植株的POD活性呈現(xiàn)急速下降的趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)栝樓葉片的抗氧化酶系受到損傷，活性氧的產(chǎn)生超出了系統(tǒng)的清除能力導(dǎo)致其大量積累而引起生物膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷。對(duì)照組與外源ABA為濃度7.5 mg·L-1、10 mg·L-1時(shí)的處理組，沒(méi)有出現(xiàn)顯著的差異。表明了外源ABA只有在一定濃度范圍內(nèi)，才能有效地調(diào)節(jié) POD的活性，防止細(xì)胞質(zhì)膜被過(guò)氧化物傷害。

圖2　不同濃度外源ABA處理對(duì)連作障礙下栝樓POD活性的影響Fig. 2 Effect on POD activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles

2.3外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓 PPO活性的影響

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）在植物中以潛伏形式存在，當(dāng)植物受到機(jī)械損傷或者病菌侵染后，PPO能迅速活化催化酚與O2發(fā)生氧化反應(yīng)形成醌，導(dǎo)致組織發(fā)生褐變，以防止或減輕感染，提高其抗病能力（張建光等，2008）。有研究表明，有些果實(shí)（比如香蕉、荔枝等）的褐變主要由PPO催化的酶促褐變所導(dǎo)致（林河通等，2005）。栝樓連作至第3年，植株果實(shí)上開(kāi)始出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，目前有待進(jìn)一步研究證實(shí) PPO酶與栝樓連作障礙之間的關(guān)系。由圖 3可知，連作栝樓在不同濃度ABA處理下，PPO活性的變化在處理組間存在顯著性差異，處理組T1、T2、T3、T4比T0分別提高了 106.11%，280.92%，347.33%，208.4%。隨ABA濃度的升高，PPO活性呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的現(xiàn)象，在ABA濃度為7.5 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值。由此可猜測(cè)，最初低濃度的ABA有效地激活了PPO酶，使PPO催化形成醌的反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞。且在一定范圍內(nèi)，隨著ABA濃度的升高，PPO濃度也逐漸升高，使植株生成較多的褐色斑點(diǎn)。當(dāng)ABA濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)，PPO濃度出現(xiàn)了降低現(xiàn)象，可能與PPO“自殺性抑制”有關(guān)（Chazarra et al.，1997）。然而，隨著PPO的活性越高，植株生成的褐色斑點(diǎn)也越多，與栝樓連作障礙出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)的癥狀相似，栝樓連作障礙的出現(xiàn)是否與PPO活性之間存在一定的聯(lián)系，還有待進(jìn)一步的研究。

圖3　不同濃度外源ABA處理對(duì)連作障礙下栝樓PPO活性的影響Fig. 3 Effect on PPO activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles

圖4　不同濃度外源ABA處理對(duì)連作障礙下栝樓CAT活性的影響Fig. 4 Effect on CAT activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles

2.4外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓 CAT活性的影響

植物在進(jìn)化過(guò)程中主要逐漸形成了消除活性氧的抗氧化酶系與非酶促系統(tǒng)，其中CAT和H2O2具有較高的親和力，主要清除線(xiàn)粒體電子傳遞、脂肪酸氧化中產(chǎn)生的 H2O2，CAT含量的變化也是H2O2在體內(nèi)變化的一種標(biāo)志性反應(yīng)（陳金峰等，2008）。由圖4可見(jiàn)，不同濃度的ABA對(duì)連作栝樓的CAT活性的影響，在部分處理組之間存在顯著性差異，處理組 T1、T2、T3比 T0分別提高了211.95%，260.67%，134.12%。隨著ABA濃度的升高CAT活性呈現(xiàn)明顯的先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，并在濃度為5 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值。表明CAT的活性對(duì)于外源ABA濃度的變化是很敏感的，外源ABA濃度為10 mg·L-1時(shí)與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明高濃度的外源ABA無(wú)法緩解植株的連作障礙，反而會(huì)抑制酶活性，給植物生長(zhǎng)帶來(lái)不利的影響。

2.5外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓 PAL活性的影響

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）是連接生物初級(jí)代謝和苯丙烷類(lèi)代謝第一步反應(yīng)的酶（李云萍等，2010），主要參與植物抗病、抗蟲(chóng)害、抗逆境的反應(yīng)。由圖 5可見(jiàn)，不同濃度ABA處理連作栝樓，PAL活性在個(gè)別處理組間出現(xiàn)顯著性差異。處理組T1、T2、T3、T4比T0分別提高了51.85%，164.22%，86.15%，68.15%。研究表明，隨著ABA濃度的升高，PAL活性呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，并在濃度為5 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大值。外源ABA濃度為2.5、7.5、10 mg·L-1時(shí)沒(méi)有顯著性差異，并且PAL活性明顯高于對(duì)照組，表明外源ABA濃度可以直接有效地調(diào)節(jié)PAL活性，但PAL活性的變化波動(dòng)并不顯著。

圖5　不同濃度外源ABA處理對(duì)連作障礙下栝樓PAL活性的影響Fig. 5 Effect on PAL activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles

2.6外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓 APX活性的影響

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX），可清除存在于細(xì)胞質(zhì)中的H2O2，是調(diào)節(jié)細(xì)胞H2O2水平一種非常重要的酶。由圖6可以看出，不同濃度的ABA處理的連作栝樓，APX活性的變化在個(gè)別處理組間出現(xiàn)顯著性差異，處理組 T1、T2、T3比 T0分別提高了 179.37%，1163.49%，82.54%，而處理組T4比T1減少了38.1%，且在濃度為5 mg·L-1時(shí)，APX活性達(dá)到峰值。植株在外源ABA濃度為2.5 mg·L-1、7.5 mg·L-1時(shí)與對(duì)照組出現(xiàn)差異，但并不明顯；當(dāng)外源ABA濃度為10 mg·L-1時(shí)，APX的活性出現(xiàn)比對(duì)照組還降低的現(xiàn)象，明確了只有小范圍內(nèi)的外源 ABA濃度可以有效提高APX活性。有研究表明，當(dāng)轉(zhuǎn)基因棉花過(guò)表達(dá)tAPX時(shí)，其PSⅡ光化學(xué)活性和抗氧化能力都得到了提升（Komyeyev et al.，2001）；tAPX過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥植株都提高了對(duì)甲基紫精引起的氧化脅迫的耐受能力（Murgia et al.，2004）。所以，外源ABA可以有效提高植株抵抗連作障礙的能力，一定程度上提高其抗氧化能力。

圖6　不同濃度外源ABA處理對(duì)連作障礙下栝樓APX活性的影響Fig. 6 Effect on APX activity of Trichosanthes kirilowii in different concentrations of exogenous ABA under the continuous cropping obstacles

2.7隸屬函數(shù)均值連作障礙緩解分析

采用模糊隸屬函數(shù)的方法，對(duì)試驗(yàn)中所測(cè)的 6個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算分析，綜合評(píng)價(jià)不同濃度脫落酸處理緩解連作障礙的能力。如表 1所示，外源ABA對(duì)緩解栝樓連作障礙的能力為 T2>T3>T1> T0>T4。由此可知，T2處理組脫落酸處理對(duì)緩解栝樓連作障礙的影響效果是最好的。

表1　緩解連作障礙隸屬函數(shù)指標(biāo)及綜合評(píng)價(jià)Table 1 Ease continuous cropping obstacles membership function indexes and comprehensive evaluation

3　討論與結(jié)果

栝樓一般種植2～3年后其產(chǎn)量會(huì)明顯下降，而且根部有局部腐爛現(xiàn)象出現(xiàn)。年度內(nèi)在植株開(kāi)花后開(kāi)始出現(xiàn)病株，表現(xiàn)為矮化、黃化、萎蔫、根腐、莖腐、傷流、凝膠等癥狀，甚至植株逐漸枯萎，病害蔓延。主要原因是栝樓連作使植物細(xì)胞膜系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基受到刺激，破壞植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡，引起活性氧的積累，導(dǎo)致氧化脅迫。氧自由基可引起膜脂過(guò)氧化，使膜脂不飽和度下降、膜流動(dòng)性降低、透性增加，并可使膜蛋白發(fā)生聚合、交聯(lián)，破壞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響植物的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致植物死亡。氧化脅迫主要是由活性氧（ROS）如單線(xiàn)態(tài)的氧、超氧負(fù)離子、過(guò)氧化氫及羥基自由基的形成導(dǎo)致的（Apel et al.，2004）。栝樓在良好的環(huán)境下，通常將活性氧（ROS）維持在較低水平，而在連作障礙條件下，細(xì)胞代謝過(guò)程不協(xié)調(diào)導(dǎo)致ROS水平升高，從而對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成潛在的氧化脅迫。另外，在細(xì)胞不同部位發(fā)生的代謝作用必然導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，ROS水平的短暫升高轉(zhuǎn)導(dǎo)植物信號(hào)進(jìn)而對(duì)植物在不利環(huán)境下的生存起著至關(guān)重要的作用（Dat et al.，2000）。而且，植物由于在光合作用過(guò)程中釋放大量的氧，作為光合作用部位的葉綠體，顯然最易受到氧化脅迫的威脅。

目前已證明的活性最強(qiáng)活性氧是·OH，它可以直接引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡（孫衛(wèi)紅等，2005）。自由基涉及到許多體內(nèi)調(diào)控機(jī)制，能否及時(shí)高效地清除活性氧直接關(guān)系到植物抗逆性的強(qiáng)弱，因此抗氧化酶系在抗逆境的研究中頗受重視。本實(shí)驗(yàn)對(duì)超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化物酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性進(jìn)行測(cè)定，探究外源ABA對(duì)栝樓連作障礙的緩解作用，對(duì)緩解栝樓連作障礙提供一些有價(jià)值的參考。當(dāng)植物受到輕度環(huán)境脅迫時(shí)，SOD和POD活性有所升高，以增強(qiáng)植物對(duì)ROS的清除能力。當(dāng)植物受到重度逆境脅迫時(shí)，SOD和POD活性又會(huì)大幅度降低，造成ROS的積累和對(duì)細(xì)胞的傷害（張瓊等，2010），這個(gè)規(guī)律在本實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。正常情況下植物體內(nèi)SOD、POD、CAT、PPO、PAL和APX活性維持在一定的水平，從而去除不斷產(chǎn)生的自由基，使植物體內(nèi)抗氧化酶系活性以及ROS含量達(dá)到一定的平衡（高曦等，2014）。在清除氧自由基的過(guò)程中，抗氧化酶之間具有協(xié)同作用。當(dāng)SOD把超氧化物歧化為H2O2后，CAT和POD在一定強(qiáng)度的環(huán)境脅迫下有互補(bǔ)的作用，因此不論H2O2濃度的高低，CAT和POD都可以高效發(fā)揮將H2O2消除的功能（李璇等，2013）。這6種抗氧化酶可能在不同的外源 ABA濃度下存在不同的應(yīng)答機(jī)制，既相互依賴(lài)，又能夠各自獨(dú)立維持植株體內(nèi)氧化平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，可以看出抗氧化酶系的變化是被誘導(dǎo)的，一定濃度的外源脫落酸，使栝樓體內(nèi)抗氧化酶系活性得到了不同程度提高，植株本身抗病菌能力也得到了提高。SOD作為唯一能特異性清除自由基的抗氧化酶，一直被認(rèn)為是抵御過(guò)氧化物毒性的重要防御機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定SOD活性可以看出外源ABA在不同的濃度下顯著影響其活性，說(shuō)明ABA是直接影響SOD活性的植物激素，外源ABA對(duì)SOD活性的調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)。當(dāng)外源ABA濃度為5 mg·L-1時(shí)，SOD活性達(dá)到峰值。在外源ABA處理中，SOD、POD、PPO、CAT、PAL、APX 6種酶活性反應(yīng)整體上表現(xiàn)出一致性，只是前 3種酶表現(xiàn)出更加敏感，明顯下降，其中以POD活性下降得最為顯著。同時(shí)，盡管SOD、POD、PPO、CAT、PAL、APX6種酶在低濃度處理時(shí)都表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng)，但活性變化的特性存在一定的差異，并非所有的指標(biāo)均在 ABA濃度為 5 mg·L-1時(shí)酶活性達(dá)到最大值，PPO活性最大值出現(xiàn)在濃度為7.5 mg·L-1時(shí)，而且PPO的活性與栝樓連作枯萎也存在著密切的關(guān)系。PPO是一種含酮氧化酶，它與植物的逆性有關(guān)。有研究表明PPO活性增強(qiáng)會(huì)使植物產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)而轉(zhuǎn)化為醌類(lèi)物質(zhì)，抑制植物不定根的產(chǎn)生，使植物漸趨死亡，即過(guò)高的多酚氧化酶活性會(huì)給植株帶來(lái)一定的傷害（楊廣超，2004）。所以，高活性PPO并不代表其能夠更加有效地緩解栝樓的連做障礙，相反可能促進(jìn)了栝樓連做障礙，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，在適當(dāng)濃度的外源ABA作用下，連作障礙下的栝樓在抗氧化酶系活性方面得到顯著的增強(qiáng)，超氧化物岐化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化物酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性總體隨處理的外源ABA濃度的升高而呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。通過(guò)模糊隸屬函數(shù)均值分析可知，5 mg·L-1的ABA為緩解連作障礙的最佳濃度。如果要從根源上消除連作障礙，還需要從根系分泌物、致病細(xì)菌和土壤微生物等因素來(lái)綜合研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源ABA濃度超出一定范圍后，植株的抗病能力不但沒(méi)有得到提高，反而可能致使生理代謝紊亂，抑制各種抗氧化酶的活性，妨礙植株正常生長(zhǎng)。雖然在栝樓連作障礙下，各種酶之間協(xié)同互作真正的機(jī)理還有待深入研究，但是本試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)明確了它們對(duì)植物細(xì)胞防御外界傷害有著重要的作用，這是防止植物在連作障礙下受到氧化物傷害的重要因素，表明抗氧化酶系活性的提高是栝樓在連作障礙下的重要生理反應(yīng)。當(dāng)然栝樓的連作障礙是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，后續(xù)的試驗(yàn)中仍需重視抗氧化酶系之間的相互作用及其與連作障礙之間的關(guān)聯(lián)，對(duì)連作障礙的致病機(jī)理也有待更加深入的探究。

APEL K, HIRT H. 2004. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction [J]. Annual Review of Plant Biology, 55(1): 373-399.

CHAZARRA S, CABANES J, ESCRIBANO J, et al. 1997. Kinetic study of the suicide inactivation of latent polyphenoloxidase from iceberg lettuce (Lactuca sativa) induced by 4-tert-butylcatechol in the presence of SDS[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1339(2): 297-303.

DAT J, VANDENABEELE S, VRANOVA E, et al. 2000. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses [J]. Cellelar and Molecular Life Sciences, 57(5): 779-795.

KOMYEYEV D, LOGAN B A, PAYTON P, et al. 2001.Enhanced photochemical light utilization and decreased chilling-induced photoinhibition of photosystem II incotton overexpression genes encoding chloroplast- targeted antioxidant enzymes [J]. Physiologia Plantarum, 133(3): 323-331.

MURGIA I, TARANTINO D, VANNINI C, et al. 2004. Arabidopsis thaliana plants overexpressing thylakoidal ascorbate peroxidase show increased resistance toparaquatinduced photooxidative stress and to nitric oxideinduced cell death [J]. The Plant Journal, 38(6): 940-953.

ZHANG L J, ZENG F L, RONG X. 2003.Effect of Lanthanum Ions (La3+) on the reactive oxygen species scavenging enzymesin wheat Leaves [J]. Biological Trace Element Research, 91(3): 243-252.

陳金峰, 王宮南, 程素滿(mǎn). 2008. 過(guò)氧化氫酶在植物脅迫響應(yīng)中的功能研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 28(1): 188-193.

高曦, 盛月慧, 高彥征. 2014.菲、芘對(duì)蠶豆的氧化脅迫和DNA損傷[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 33(10): 1873-1881.

韓超, 申海玉, 葉嘉, 等. 2012.外源脫落酸對(duì)小麥幼苗抗鎘脅迫能力的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 32(4): 745-750.

李?lèi)?ài)峰. 2014. 栝樓果皮化學(xué)成分研究[D]. 濟(jì)南: 山東中醫(yī)藥大學(xué): 11-24.

林河通, 席玙芳, 陳紹軍. 2005. 龍眼果實(shí)采后失水果皮褐變與活性氧及酚類(lèi)代謝的關(guān)系[J]. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào), 31(3): 287-297.

李璇, 岳紅, 王升, 等. 2013. 影響植物抗氧化酶活性的因素及其研究熱點(diǎn)和現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)中藥雜志, 38(7): 973-977.

李云萍, 郭晉雅. 高峰. 2010. 紫心甘薯花青素積累與 PAL活性的關(guān)系[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 32(2): 68-72.

羅立津, 徐福樂(lè), 翁華欽, 等. 2011. 脫落酸對(duì)甜椒抗寒性的誘導(dǎo)效應(yīng)及其機(jī)理研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 31(1): 94-100.

盧富桃, 黃露寧, 史婷婷, 等. 2014. 外源Ca2+對(duì)藥用植物栝樓抗旱機(jī)制的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 42(3): 42-44.

錢(qián)驊, 趙伯濤, 黃曉德, 等. 2014. 栝樓組織培養(yǎng)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)通報(bào), 30(28): 159-163.

任靜, 何家慶. 2010. 栝樓籽資源的利用及其價(jià)值[J]. 中國(guó)野生植物資源, 20(6): 21-22.

孫衛(wèi)紅, 王偉青, 孟慶偉. 2005. 植物抗壞血酸過(guò)氧化物酶的作用機(jī)制、酶學(xué)及分子特性[J]. 植物生理學(xué)通訊, 41(2): 143-147.

中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所, 上海市植物生理學(xué)會(huì). 1999. 現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]., 北京: 科學(xué)出版社: 314-316.

王玲娜. 2010. 內(nèi)蒙芹菜連作障礙微生物修復(fù)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué): 1-6.

吳玲云, 周波, 李玉花. 2014植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子在脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用[J]. 分子植物育種, 12(2): 404-410.

熊利芝, 吳玉先, 王家堅(jiān), 等. 2014. 栝樓籽蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化及抗氧化性[J]. 精細(xì)化工, 31(12): 1471-1475.

楊廣超. 2004. 西瓜自毒作用及其機(jī)制的研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué): 4-21.

楊麗娜, 劉捷, 陶建敏. 2008. 栝樓的組織培養(yǎng)及快速繁殖[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), (2): 89-94.

張超. 2014. 外源脫落酸對(duì)灰楊(Populus × canescens)響應(yīng)鎘脅迫的影響[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué): 14-18.

張建光, 陳少春, 李英麗, 等. 2008. 高溫強(qiáng)光脅迫對(duì)蘋(píng)果果皮PPO活性的影響[J]. 確生態(tài)學(xué)報(bào), 28(10): 4645-4651.

張瓊, 伍琴, 高香玉, 等. 2010. 二溴聯(lián)苯醚對(duì)纖細(xì)裸藻的生態(tài)遺傳毒性效應(yīng)[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 30(6): 833-838.

鄒琦. 2000. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社: 211-219.

周媛, 章藝, 吳玉環(huán), 等. 2012. 酸鋁脅迫對(duì)栝樓根系生長(zhǎng)及鋁積累的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 30(12): 2434-2439.

Effect of Exogenous Abscisic Acid on Anti-oxidative Enzymes of Replanted Trichosanthes kirilowii Maxim.

LIU Dan1,2, WU Yuhuan3, SHEN Yang1, PAN Shaoan1, ZHANG Lujun1, CAO Lin2, MA Li2, LI Feng1, ZHANG Yi4, XU Gendi1,2, LIU Peng1,2*
1. Research Institute of Ecology, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 2. Research Institute of Botany, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China; 3. College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 330036, China; 4. Tourism College of Zhejiang, Hangzhou 311231, China

To figured out the mechanism of mitigating the injure of continuously-cropping obstacle with abscisic acid Trichosanthes kirilowii which had continuously cultivated for three years under normal circumstance was chosen as experimental materials to explore the effect of abscisic acid (ABA) which irrigating with different concentrations (0, 2.5, 5, 7.5, 10 mg·L-1) on activities of antioxidant enzymes in leaves . The results showed that the activities of antioxidant enzymes of Trichosanthes kirilowii seedlings which had treated with exogenous ABA for seven days and measured activity of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), peroxidase (CAT), polyphenol oxidase (PPO), phenylalanine ammonia lyase (PAL) and ascorbate peroxidase (APX) of the leaves sample after another seven days showed a downward trend after a rise trend under normal circumstances. In addition to PPO activity which peak concentration of exogenous ABA is 7.5 mg·L-1, the remaining enzyme activities peaks occurred at 5 mg·L-1. When the concentration of exogenous ABA is too high, it appeared the phenomenon that the SOD, POD and CAT activities are lower than the activities of control group and other disadvantageous circumstances. The membership function analysis concluded that when the concentration of exogenous ABA is 5 mg·L-1, the ABA can effectively alleviate the injury of continuously-cropping obstacles of Trichosanthes kirilowii.

continuously-cropping obstacle; Trichosanthes kirilowii Maxim.; abscisic acid; anti-oxidative enzymes

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.12.010

Q945.79; X17

A

1674-5906（2015）12-1989-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41541049；30540056）；浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2011C22053）

劉丹（1991年生），女，碩士研究生，主要從事環(huán)境修復(fù)和植物營(yíng)養(yǎng)的研究。E-mail: liudan22041991@sina.com *通信作者：劉鵬（1965年生），男，教授，博士，主要從事生理生態(tài)、環(huán)境修復(fù)和植物營(yíng)養(yǎng)的研究。E-mail: pliu99@vip.sina.com

2015-09-26

引用格式：劉丹, 吳玉環(huán), 沈洋, 潘少安, 張露軍, 曹林, 馬麗, 酈楓, 章藝, 徐根娣, 劉鵬. 外源脫落酸對(duì)連作障礙下栝樓抗氧化酶系的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2015, 24(12): 1989-1994.