李偉莉，熊程俏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，安徽合肥 230031)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是婦產(chǎn)科臨床中較為常見的疾病，在育齡婦女中其發(fā)生率約占1% ～2%，同時又占所有妊娠丟失的15% ～20%。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在中醫(yī)稱為“滑胎”，其具有屢孕屢墮的特點(diǎn)，這與人類生活節(jié)奏的加快和環(huán)境的變化等因素密切相關(guān)，隨著連續(xù)流產(chǎn)次數(shù)的增加，流產(chǎn)反復(fù)發(fā)生的傾向也越來越大。當(dāng)自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生1、2、3次后，臨床上再次妊娠后流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)則逐漸升高，分別為 13%、37%、84%［1］，大量的研究表明該病與遺傳、免疫、內(nèi)分泌、感染及血栓形成等諸多因素有關(guān)。臨床自然流產(chǎn)多繼之于胚胎停止發(fā)育，研究顯示與母胎界面的血管生成有關(guān)［2-4］。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為最主要的血管生成相關(guān)因子，在血管生成中起到重要作用。我們既往的研究表明補(bǔ)腎健脾中藥(補(bǔ)腎安胎沖劑)治療自然流產(chǎn)的患者有很好的臨床療效［5-7］，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌免疫紊亂的作用。本研究擬通過建立復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型觀察復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠蛻膜VEGF及微血管密度(microvessel density，MVD)的表達(dá)及中藥干預(yù)，探討補(bǔ)腎健脾中藥對蛻膜血管生成的影響，為中藥保胎提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雌性CBA/J小鼠，雄性DBA/2及BALB/c小鼠，由安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:許可證號:scxk［皖］2011-002)。

1.2 藥物及試劑 補(bǔ)腎安胎沖劑組成:菟絲子、川斷、桑寄生、熟地、太子參、白術(shù)、黃芩等，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供(BZ20080017);黃體酮膠囊:浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格:50 mg×20粒(120638)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 自動包埋機(jī)(TB-718，德國萊卡);病理切片機(jī)(LEICA RM2135，德國萊卡);顯微圖象分析系統(tǒng)(BX51熒光顯微鏡，DP70數(shù)碼攝像裝置，JD形態(tài)分析系統(tǒng)，日本OLYMPUS)。Ribbit Anti-VEGF(980896W，bioss)，Ribbit Anti-CD34(980207W，bioss);PV-6000(K127719A)，DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型復(fù)制與分組 采用具有隱性、反復(fù)性和父系特異性特征的DBA/2XCBA的Clark經(jīng)典反復(fù)流產(chǎn)小鼠模型［8］。將雌性CBA/J小鼠分別與雄性DBA/2及BALB/c小鼠分別按2∶1合籠交配，分別建立RSA模型CBA/J×DBA/2與正常妊娠模型CBA×BALB/c，雌雄2∶1分籠飼養(yǎng)檢出陰栓者計(jì)為妊娠第0天。將68只雌鼠隨機(jī)分為:正常組、模型組、西藥(黃體酮)組、中藥(補(bǔ)腎安胎沖劑)組。正常組、模型組給予蒸餾水灌胃;西藥組予黃體酮膠囊(0.4 mg·kg-1·d-1)灌胃;中藥組予補(bǔ)腎安胎沖劑(3.0 g·kg-1·d-1)灌胃，各組均 15 d。

2.2 樣本采集 末次給藥24 h后，處死小鼠剖腹并完整分離留取卵巢、子宮組織，去除周圍結(jié)締組織，取一側(cè)子宮置于10%中性福爾馬林固定備用;另一側(cè)子宮裝入凍存管中，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 流產(chǎn)率的計(jì)算 正常胚胎粗大如串珠狀，宮內(nèi)未見瘀血，胚胎呈淡紅色;流產(chǎn)胚胎宮內(nèi)見明顯瘀血，胚胎呈黑褐色，或子宮呈竹節(jié)樣改變，或僅見到胚胎著床點(diǎn)，或胚胎已完全或部分消失。流產(chǎn)率=流產(chǎn)胚胎數(shù)/(流產(chǎn)胚胎數(shù)+正常胚胎數(shù))×100%。

2.4 指標(biāo)檢測 參照二步法免疫組化檢測試劑盒(PV-6000)和 DAB酶底物顯色試劑盒的說明書要求進(jìn)行操作，檢測VEGF及MVD的表達(dá)情況。以細(xì)胞胞漿、胞核中出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性反應(yīng)。采用江蘇捷達(dá)JD-801圖像分析系統(tǒng)，在相同視野下，對免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的積分光密度進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間的比較采用單因素方差分析+多重比較。顯著性水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 各組流產(chǎn)率的比較 與正常組相比較，模型組的流產(chǎn)率顯著升高(P＜0.01);與模型組相比較，西藥組及中藥組小鼠流產(chǎn)率顯著降低(P＜0.01)，見表1。

表1 各組小鼠流產(chǎn)率的比較(±s)

表1 各組小鼠流產(chǎn)率的比較(±s)

組別 例數(shù) 流產(chǎn)率/%A:正常組17 2.08 ±1.09 B:模型組 17 70.59 ±16.85 C:西藥組 17 36.76 ±15.51 D:中藥組 17 29.71 ±16.25整體比較:F，P 84.67，0.000多重比較:LSD-t，P A vs B 15.85，0.000 A vs C 8.03，0.000 A vs D 6.39，0.000 B vs C 7.23，0.000 B vs D 8.74，0.000 C vs D 1.51，0.136

3.2 各組VEGF在蛻膜中的表達(dá)情況 在正常組、西藥組及中藥組小鼠蛻膜中，VEGF主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中。與正常組比較，模型組中VEGF的表達(dá)均減少(P＜0.05)。與模型組比較，西藥組及中藥組小鼠蛻膜中VEGF表達(dá)顯著升高(P ＜0.05或 P ＜0.01)。見表2，圖1。

表2 各組蛻膜中VEGF積分光密度值(IOD)的比較(±s)

表2 各組蛻膜中VEGF積分光密度值(IOD)的比較(±s)

組別 例數(shù)VEGF A:正常組17 4.24 ±1.48 B:模型組 17 3.09 ±0.58 C:西藥組 17 3.88 ±0.97 D:中藥組 17 4.17 ±1.02整體比較:F，P 2.71，0.013多重比較:LSD-t，P A vs B 2.45，0.021 A vs C 0.78，0.446 A vs D 0.15，0.885 B vs C 2.66，0.017 B vs D 2.71，0.009 C vs D 0.64，0.535

3.3 各組蛻膜中MVD表達(dá)的比較 用CD34單克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，并進(jìn)行著色的微血管計(jì)數(shù)。與正常組相比較，模型組小鼠蛻膜中MVD表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與模型組相比較，西藥組及中藥組小鼠蛻膜中MVD表達(dá)顯著升高(P＜0.05或 P ＜0.01)。見表3，圖2。

表3 各組蛻膜中MVD的比較(±s)

表3 各組蛻膜中MVD的比較(±s)

組別 例數(shù)MVD A:正常組17 17.90 ±6.01 B:模型組 17 7.60 ±3.44 C:西藥組 17 14.82 ±5.06 D:中藥組 17 15.60 ±5.15整體比較:F，P 7.93，0.000多重比較:LSD-t，P A vs B 4.60，0.000 A vs C 1.41，0.167 A vs D 1.03，0.310 B vs C 3.30，0.002 B vs D 3.57，0.001 C vs D 0.36，0.723

4 討論

正常妊娠需要母胎界面具有豐富而完善的血管網(wǎng)絡(luò)，早期妊娠中母體與胎兒之間血管的發(fā)育及其網(wǎng)絡(luò)的形成是保證營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行正常交換的前提，對胚胎的存活起著十分重要的作用。與正常妊娠相比，臨床上流產(chǎn)是一種常見的病理妊娠，研究表明隨著妊娠次數(shù)的增加其反復(fù)發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加，因此，研究蛻膜中血管的發(fā)育和形成對正常妊娠有著十分重大的意義。VEGF作為主要的血管內(nèi)皮生成因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和調(diào)控血管生成的作用?；诹鳟a(chǎn)患者蛻膜組織的研究表明，VEGF表達(dá)減少或不表達(dá)，可導(dǎo)致血管網(wǎng)形成不良或滋養(yǎng)細(xì)胞分化、浸潤異常，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生［9］。MVD是顯示血管形成活性的重要指標(biāo)，它反映了組織中血液灌注的情況。

本研究結(jié)果表明正常組孕鼠VEGF及MVD的表達(dá)均顯著高于模型組，說明模型組蛻膜中血管的數(shù)量明顯低于正常組，這與報(bào)道流產(chǎn)患者蛻膜血管發(fā)育不良，表現(xiàn)為血管數(shù)目少、管腔狹小或無明顯管腔、腔內(nèi)血細(xì)胞少、血管發(fā)育不良的狀態(tài)［10］是一致的，因此，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠存在VEGF及MVD表達(dá)的顯著降低，從而影響蛻膜中血管不能正常發(fā)育，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。與模型組相比，中藥組VEGF及MVD表達(dá)顯著升高，同時，其流產(chǎn)率顯著降低，則提示補(bǔ)腎健脾中藥的干預(yù)，可能通過調(diào)節(jié)提高VEGF及MVD的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成，為母胎之間提供充足的營養(yǎng)，降低流產(chǎn)的發(fā)生。

補(bǔ)腎安胎沖劑(菟絲子、川斷、桑寄生、熟地、太子參、白術(shù)、黃芩等)是以補(bǔ)腎健脾之法為主進(jìn)行組方，經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗(yàn)積累所制成的院內(nèi)制劑，其臨床療效十分顯著［11］，本方中以菟絲子、太子參為君，菟絲子補(bǔ)腎固精;太子參補(bǔ)脾腎之氣，益生殖之精。桑寄生補(bǔ)腎調(diào)肝;川斷補(bǔ)肝腎，調(diào)血脈;熟地養(yǎng)血益精;白術(shù)補(bǔ)脾益胃共為臣藥。黃芩清熱涼血安胎，與白術(shù)相配見朱丹溪“安胎圣藥”之妙。全方切中流產(chǎn)脾腎虧虛的病機(jī)，補(bǔ)腎健脾使血足氣旺，沖任協(xié)調(diào)，補(bǔ)先天益后天，共奏安胎之功。中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖，主藏精，為先天之本，胞脈系于腎，腎氣旺盛是女性生殖之本，腎氣旺盛、氣血充足、沖任協(xié)調(diào)才能使血旺養(yǎng)胎，這一點(diǎn)與妊娠期母胎之間的血管生成相似［12-13］。本研究結(jié)果也顯示，補(bǔ)腎健脾中藥能上調(diào)其VEGF及MVD的表達(dá)，促進(jìn)血管的形成，為胚胎提供充足的血供，降低了流產(chǎn)率，從而為蛻膜血管方面中藥保胎作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)小鼠存在VEGF及MVD表達(dá)的降低，影響蛻膜血管的發(fā)育，導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生。補(bǔ)腎健脾中藥能上調(diào)VEGF及MVD的表達(dá)，促進(jìn)血管的形成，豐富母胎之間的血管網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)胚胎生長發(fā)育。然而，中藥干預(yù)保胎的具體作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步探討。

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