齊東江，徐阿曼，2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院普外科，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，安徽合肥 230022)

奧美拉唑(omeprazole，OME)是一類治療胃食管反流病、慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病的重要藥物，并普遍用于根除幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)感染，其作用機制是阻斷胃壁細胞分泌管上H+/K+-ATP酶的活性從而阻斷刺激因素引起的胃酸分泌。近年來有研究顯示長期使用OME可引起一系列的不良反應(yīng)［1-3］，如:胃壁細胞增生、腺囊腫、高胃泌素血癥及胃底腺息肉、胃癌等。目前對OME對溶酶體膜上Ⅴ-ATP酶是否具有抑制作用的研究較少。本研究通過長期給予小鼠OME，觀察其是否會抑制小鼠溶酶體膜上的Ⅴ-ATP，從而影響小鼠的免疫功能，以期為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 實驗動物與試劑

清潔級昆明種小鼠，雄性，30只，體質(zhì)量24～26 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(動物合格證號SCXK(皖)2005-001號)。奧美拉唑由山東新時代藥業(yè)有限公司提供，批號:009131003。酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)ELISA 檢測試劑盒、N-乙酰-β-D-氨 基 葡 萄 糖 苷 酶 (N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)ELISA檢測試劑盒購自蘇州卡爾文生物科技有限公司，批號分別為 E20141031A、E20141031A;TDZ42WS低速臺式離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司;FA2204B電子天平購自上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;Sunrise-Basic tecan酶標儀購自瑞士Tecan公司。

2 試驗方法

2.1 動物模型建立與分組 小鼠飼養(yǎng)聚丙烯籠內(nèi)標準條件下飼養(yǎng)，溫度維持在24℃，自由進食飲水。30只小鼠隨機分為對照組、OME低劑量組、OME高劑量組。OME低劑量、高劑量組小鼠每天給予OME灌胃，低劑量組為(6 mg·kg-1·d-1)、高劑量為(30 mg·kg-1·d-1)。每周稱量體質(zhì)量1次，24周后處死小鼠，收取標本，處死前小鼠禁食24 h。

2.2 小鼠脾重量指數(shù)測定 小鼠稱量體質(zhì)量后脫頸椎處死，取出小鼠脾臟，濾紙吸干殘留血液，分析天平稱重。計算脾重量指數(shù)，脾重指數(shù)=脾臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.3 小鼠胸腺重量指數(shù)測定 小鼠稱量體質(zhì)量后脫頸椎處死，取出小鼠胸腺，濾紙吸干殘留血液，分析天平稱重。計算脾重量指數(shù)，胸腺重指數(shù)=胸腺重量(mg)/體質(zhì)量(g)。

2.4 小鼠血清中ACP及NAG含量測定 小鼠眼眶取血，離心后取上清，-80℃凍存?zhèn)溆?。采用ELISA法測定血清及組織中ACP和NAG含量，實驗步驟嚴格按照操作說明書操作，450 nm處測定吸光度值。

2.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析。觀測資料均為計量資料，以均數(shù)±標準差表示(±s)，均通過正態(tài)性檢驗。多組間比較采用one-way ANOVA，兩兩多重比較為LSD-t檢驗。以P＜0.05為顯著性差異意義。

3 結(jié)果

3.1 OME對小鼠脾重量指數(shù)的影響 各組小鼠體重和脾重指數(shù)見圖1。從圖1可見，長期使用OME均導(dǎo)致小鼠脾重指數(shù)下降(F=11.848，P＜0.01)。與對照組相比，OME組小鼠脾重指數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，其中OME高劑量組與對照組相比小鼠脾重指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3.2 OME對小鼠胸腺指數(shù)的影響 各組小鼠胸腺指數(shù)見圖2。圖2可見，長期使用OME均可導(dǎo)致小鼠胸腺指數(shù)下降(F=2.804，P ＜0.01)。與對照相比，OME低劑量組小鼠脾重指數(shù)下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，OME高劑量組小鼠脾重指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3.3 OME對小鼠血清中ACP及NAG含量影響OME組給藥24周后小鼠血清中ACP及NAG含量均減少(F=2.959，P ＜ 0.01;F=13.984，P ＜0.01)。與對照組相比，OME低劑量組ACP及NAG含量均有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，OME高劑量組與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)(見圖3，4)。

4 討論

溶酶體是一種參與細胞分解代謝的酸性細胞器(pH 4.5～5.5)，普遍存在于哺乳動物的各種細胞中，除了成熟的紅細胞［4］。在細胞免疫中T細胞抗原呈遞、T淋巴細胞清除病原微生物、受損的細胞及腫瘤細胞以都需要溶酶體酶的參與［5-6］。細胞自噬發(fā)揮其正常的功能同樣也需要溶酶體及其蛋白酶的參與，因此它在人體防御及免疫反應(yīng)中扮演重要的角色［7］。溶酶體蛋白水解酶的活性需要高酸環(huán)境來維持(pH在4.5到5.0之間)。溶酶體通過一種質(zhì)子泵V-ATP酶消耗ATP將H+逆電子梯度轉(zhuǎn)入溶酶體內(nèi)，從而形成和維持pH梯度的穩(wěn)定［8］。

ACP及NAG均是溶酶體內(nèi)水解酶，而且ACP又是溶酶體的特征性酶，分析兩者的含量可以直接反應(yīng)溶酶體酶的含量。本實驗中發(fā)現(xiàn)OME組小鼠血清中ACP及NAG水平均較對照組低，并呈現(xiàn)一種劑量依賴性。這提示小鼠體內(nèi)溶酶體呈一種抑制狀態(tài)，這可能是OME抑制溶酶體膜上的V-ATP酶，破壞了溶酶體內(nèi)的高酸環(huán)境，抑制溶酶體內(nèi)蛋白酶的活化。抑制V-ATP酶的活性同時也會損壞細胞的內(nèi)吞作用和自噬，甚至是溶酶體酶功能的喪失［9］。

本研究同時顯示長期使用OME組小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)較對照組均呈現(xiàn)下降趨勢，其中高劑量組脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)下降明顯。胸腺及脾臟是重要免疫器官，胸腺是T淋巴細胞分化成熟的中樞免疫器官，能誘導(dǎo)胸腺細胞分化成熟為功能不同的T細胞亞群;脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，是具有免疫活性的T細胞和B細胞依據(jù)和接受抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所［10］。因此脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)可直接體現(xiàn)機體的免疫水平并可衡量藥物對免疫器官的抑制作用。說明長期高劑量服用OME對小鼠的免疫存在一定的損傷。機體的免疫功能狀態(tài)是影響腫瘤治療轉(zhuǎn)歸的重要因素［11］，對提高腫瘤患者的生存率、改善生活質(zhì)量具有重要作用，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)系密切。因此，長期使用OME可能是通過抑制溶酶體功能從而引起系統(tǒng)性的免疫功能損傷，這可能也是其導(dǎo)致胃癌發(fā)生一個主要因素。

目前臨床醫(yī)師對質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPIs)使用指征把握不準和大量不規(guī)范用藥導(dǎo)致奧美拉唑使用泛濫。在澳大利亞、愛爾蘭和英國使用PPIs的患者中，分別有63%、33%和67%的患者沒有按照標準使用該藥［12］。武航海等［13］統(tǒng)計所屬醫(yī)院2011—2012年 OME使用情況發(fā)現(xiàn)10 000張含OME的處方，其中1 752張為不合理處方。因此，對于需要長期使用OME的患者，建議定期完善相關(guān)檢查，如胃鏡等。同時本研究存在一定的不足，實驗樣本量較小，有待大樣本實驗近一步探索研究。本研究對于合理、規(guī)范化使用PPIs具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

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