劉俊杰 劉茜 陳曉寧 姜俊慧

（山東綠葉制藥有限公司，山東煙臺 264003）

脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

劉俊杰 劉茜 陳曉寧 姜俊慧

（山東綠葉制藥有限公司，山東煙臺 264003）

脂肪酶主要應(yīng)用于食品工業(yè)，本研究從10份土壤樣品中通過富集培養(yǎng)分離出6株產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵，平板劃線；然后對脂肪酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，以葡萄糖1.5%、硫酸銨0.7%、磷酸氫二鉀0.1%、牛肉膏1.25%、硫酸鎂0.211%、橄欖油乳化液1.41%為發(fā)酵培養(yǎng)基，在250r/min、30℃下培養(yǎng)72h。此時可獲得高產(chǎn)的脂肪酶菌株。酶活力的最適條件：溫度50℃，pH 8.5，水浴30min。此時測定的酶活力最大。最后，對分離菌株進(jìn)行常規(guī)方法的細(xì)菌鑒定。

微生物；脂肪酶；篩選

脂肪酶是一類非常重要的水解酶，是目前應(yīng)用最為廣泛的工業(yè)用酶之一，脂肪酶目前主要應(yīng)用于食品工業(yè)。利用脂肪酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應(yīng)來生產(chǎn)各種香精酯，作調(diào)料劑；使用具有1,3－專一性的微生物脂肪酶提高食用油營養(yǎng)價值和增加食用油的花色品種，制備代可可酯等高檔油脂；另外，脂肪酶還可以用于酒類的去濁除渣、改善面包質(zhì)量，改善蛋白的發(fā)泡等等方面。脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中，來源廣泛。在各種來源的脂肪酶中，以細(xì)菌脂肪酶在有機(jī)相催化的反應(yīng)類型最多、反應(yīng)活性及穩(wěn)定性最高，其中假單孢菌屬菌株所產(chǎn)脂肪酶尤為顯著。脂肪酶（Lipase EC3.1.1.3）又稱三酰基甘油?；饷?，是一種特殊的酯鍵水解酶，它不需要輔酶即可催化油水界面的甘油三酯水解生成甘油及長鏈脂肪酸。脂肪酶的水解底物一般為天然油脂，水解部位是底物甘油三酯中1（或3）位和2位的酯鍵，反應(yīng)產(chǎn)物為甘油二酯、甘油單酯、甘油和脂肪酸。從催化特性來看，脂肪酶可以催化酯類化合物的分解、合成以及酯交換，具有化學(xué)選擇性和高度的立體異構(gòu)專一性，且此反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶反應(yīng)的重要特征是異相系統(tǒng)反應(yīng)（即在油—水的界面上作用）或有機(jī)相中的作用。這不僅發(fā)展了“界面酶學(xué)”，也促進(jìn)了“非水酶學(xué)”的研究[1-5]。脂肪酶主要采用從生物體中提取的方法來獲得，但由于動植物含酶量少、生長周期長、培養(yǎng)條件復(fù)雜，因此在制取酶時常以微生物作為原料，并且微生物資源豐富，生產(chǎn)不受自然環(huán)境的影響，可用人工控制來大量生產(chǎn)目的酶。此種方法產(chǎn)酶周期短，生產(chǎn)成本低，是一種經(jīng)濟(jì)而實用的方法。

脂肪酶作為新的生物催化劑有著得天獨厚的優(yōu)越性，其在此方面的應(yīng)用需進(jìn)行更深入的研究。利用脂肪酶催化技術(shù)轉(zhuǎn)化廢棄油脂為生物柴油，不僅拓寬了脂肪酶的應(yīng)用范圍，提供了可替代能源，而且可變廢為寶，減少環(huán)境污染。本課題的目的是篩選具有脂肪酶高產(chǎn)活性的菌株，為下一步研究其催化活性作準(zhǔn)備。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

聚乙烯醇（PVA），上海石化水處理廠。橄欖油，化學(xué)純，上?；瘜W(xué)試劑供應(yīng)站。蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、黃豆粉、葡萄糖，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂、氯化鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。硫酸銨，化學(xué)純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。碳酸鈉，化學(xué)純，天津博迪化工股份有限公司。維多利亞藍(lán)B，化學(xué)純，天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-TP11-5架盤藥物天平，上海精科天平儀器廠；

ALC110.4電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；

SW-CJ-1G型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

SK-1快速混勻器，金壇市富華儀器有限公司；

SHP-2500型低溫生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

HZQ-Q全溫振蕩器，東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；

顯微鏡，奧林巴斯；

高溫滅菌鍋。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

2.1.1 富集培養(yǎng)基的配置

富集培養(yǎng)基的組成包括橄欖油2.0%、硫酸銨0.5%、蛋白胨1.0%、磷酸氫二鉀0.5%、七水硫酸鎂0.1%，用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至9.5～10.0。

2.1.2 肉汁胨培養(yǎng)基的配置

肉汁胨培養(yǎng)基的組成成分主要包括牛肉膏為0.3%，蛋白胨為1.0%，氯化鈉為0.5%，瓊脂為1.5%～2.0%，pH為7.0～7.2。

2.1.3 平板分離培養(yǎng)基的配置

在肉汁胨培養(yǎng)基中加入2.5%橄欖油和1.5%瓊脂，用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH至9.5～10.0，滅菌后冷卻到60℃，加入維多利亞藍(lán)B（4mg/100mL），保持無菌條件乳化1min倒平板。

2.1.4 初篩培養(yǎng)基的配置

橄欖油雙層瓊脂平板，底層含瓊脂1.5%、橄欖油0.5%，分裝試管（10mL/支），滅菌后乳化（快速混勻），倒平板；表層為肉汁胨培養(yǎng)基（含1.5%瓊脂），分裝試管（10mL/支）滅菌，待底層凝固后倒平板。

2.1.5 復(fù)篩培養(yǎng)基的配置

復(fù)篩培養(yǎng)基的組成包括黃豆粉2.0%、玉米漿2.0%、可溶性淀粉1.0%、磷酸氫二鉀0.5%、硝酸鈉0.5%，pH為9.0，300mL三角瓶裝液30mL，0.1MPa滅菌20min。

2.1.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的配置組成

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成包括葡萄糖1.5%、硫酸銨0.7%、磷酸氫二鉀0.1%、牛肉膏1.25%、硫酸鎂0.211%、橄欖油乳化液1.41%，300mL三角瓶裝液，121℃滅菌20min。

2.2 土樣的采集

從濟(jì)南、威海、青島、濰坊、煙臺等地采集了啤酒廠、面粉廠、菜市場、污水場附近土樣10份。

2.3 土樣的處理

稱取1g土樣，加入盛有10mL無菌水的試管中，充分震蕩，靜置。

2.4 菌種的篩選

2.4.1 富集培養(yǎng)

取處理后的土樣上清液5mL加入盛有25mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、150r/min搖瓶培養(yǎng)。3～5d后，移取5mL培養(yǎng)液至另一盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)同樣操作2～3次，平板分離[6]。

2.4.2 平板分離

用接種環(huán)沾取一定量的經(jīng)過富集培養(yǎng)的菌液，在平板上劃線，30℃培養(yǎng)2～3d。

2.4.3 斜面保藏

將平板中有藍(lán)綠色變色圈的菌落挑至肉汁胨培養(yǎng)基上保藏，供初篩用。

2.4.4 初篩

將平板分離到的菌株從新鮮斜面上用無菌水洗下，經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布初篩培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3d。將初篩中透明圈較大的菌落挑至肉汁胨斜面培養(yǎng)基上保藏，供復(fù)篩用。

2.4.5 復(fù)篩培養(yǎng)

挑取一環(huán)新鮮肉汁胨斜面種子，接入肉汁胨液體種子培養(yǎng)基中，30℃、150r/min培養(yǎng)24h。然后取1mL液體種子于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150r/min條件下，搖瓶發(fā)酵72h。發(fā)酵液離心（3000r/min，20min），取上清液測酶活。

2.4.6 發(fā)酵培養(yǎng)

取酶活性高的菌株發(fā)酵液5mL，接入到發(fā)酵培養(yǎng)集中，30℃、220r/min下72h。然后取發(fā)酵液于3000r/min條件下離心20min，取上清液測酶活。

2.5 脂肪酶活性的檢測

2.5.1 酶活的定義

在40℃、pH9.0的條件下，水解橄欖油每分鐘產(chǎn)生1μmol游離脂肪酸所需的酶量單位（U）[7]。

2.5.2 固體瓊脂平板測定法

1）瓊脂平板的制備

分別將2.5g瓊脂粉、6.25mL橄欖油、0.2g/L聚乙烯醇18.75mL、0.1g/L維多利亞藍(lán)B 2.5mL，加入500mL三角瓶中，加熱溶解瓊脂粉，趁熱用高速組織搗碎機(jī)均質(zhì)，倒平皿，靜置冷卻，制成含酶作用底物和指示劑的固體瓊脂平板。

2）應(yīng)用平板法測定酶活性

在已制成的固體瓊脂平板上用打孔器打孔（直徑3.5mm），打孔后用注射針頭將孔內(nèi)瓊脂挑出，在酒精燈上烘烤背面，使瓊脂與平皿底部貼緊，將30μL待測酶液加入孔中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)一段時間，定時觀察孔周圍的變色情況。變色圈越大說明產(chǎn)酶的能力越強(qiáng)，反之則越弱。

3）堿性脂肪酶活力測定

橄欖油與2%聚乙烯醇溶液以1:5體積比進(jìn)行混合，高速勻漿，成為乳白色均勻穩(wěn)定的乳化液。以橄欖油乳化液為底物，在pH 9.5、40℃下，反應(yīng)30min，用滴定法測定產(chǎn)生的脂肪酸，以分解底物（橄欖油）釋放出1mmol/min游離脂肪酸所需酶量定義為1個堿性脂肪酶活力國際單位（IU），以IU/mL表示[8]。

2.6 菌種的保藏

經(jīng)過實驗篩到合適的菌株后，需要將菌株進(jìn)行保藏。

2.6.1 凍存液的配置

配置凍存液10mL，凍存液的組成包括甘油1g、氯化鈉0.09g、純化水9.2mL。

2.6.2 方法

10mL凍存液分裝到10個無菌的1.5mL離心管，在無菌條件下，從相應(yīng)斜面上挑取一大環(huán)菌體（因為在凍存過程中會有部分菌體死亡）接入離心管中，做好標(biāo)記，然后放入冰箱中凍存。

2.7 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的測定

2.7.1 酶最適作用溫度

在不同溫度下（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）進(jìn)行酶活測定，得到相同的酶液在不同的反應(yīng)溫度下所具有的酶活力單位[9]。

2.7.2 酶最適作用pH

配制11種從pH 5～10，間隔為0.5pH單位的緩沖液，利用平板測定法測出酶反應(yīng)的最適pH。

2.7.3 反應(yīng)時間對酶活的影響

將酶在不同的靜置時間（5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min）取樣測定酶反應(yīng)液中酶的活力，作圖。

2.7.4 穩(wěn)定時間對酶活的影響

根據(jù)反應(yīng)時間的長短在5～40min間隔相同時間取樣，測定反應(yīng)結(jié)束后酶活性的變化情況并作圖。

2.8 高活性菌株的分離鑒定

根據(jù)菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及主要生理生化特征對篩選出的高活力的菌株進(jìn)行鑒定。菌種生理生化鑒定主要參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]。

通過對所篩選出的菌株進(jìn)行普通的細(xì)菌染色，觀察其形態(tài)特征。進(jìn)行革蘭氏染色進(jìn)一步確定該菌株的各種主要特性。通過整個篩選過程了解菌株的培養(yǎng)特性了解該菌株生長所需的最佳溫度、pH、產(chǎn)酶活性最高的反應(yīng)時間及靜置時間。采用生理生化及16sRNA方法鑒定最終確定我們所篩選出的菌株的類型。

3 結(jié)果與分析

3.1 脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

從10份土樣中，經(jīng)過富集培養(yǎng)、平板劃線、初篩、斜面接種、復(fù)篩共獲得6株產(chǎn)脂肪酶的菌株。根據(jù)菌株產(chǎn)生脂肪酶后再加入維多利亞藍(lán)B的培養(yǎng)基中可產(chǎn)生藍(lán)綠色變色圈這一特征，挑選出產(chǎn)脂肪酶的菌株，并與不產(chǎn)脂肪酶的菌株進(jìn)行對照（圖1）。

圖1 菌種篩選結(jié)果Fig.1Strain screening results

3.2 酶活測定

3.2.1 固體瓊脂平板法

圖2 固體瓊脂平板法測定結(jié)果Fig.2Test result with solid agar plate method

圖2顯示的是固體瓊脂平板法測定結(jié)果。圖中，平板上的1、2、3、4、5、6個透明圈分別代表所篩選出的六株不同的產(chǎn)脂肪酶的菌株菌懸液所產(chǎn)生的透明圈。平板中加入維多利亞藍(lán)B作為指示劑，遇酸變藍(lán)。其作用機(jī)理為：脂肪酶產(chǎn)生菌可產(chǎn)生脂肪酶，脂肪酶可以分解加入培養(yǎng)集中的橄欖油，使其轉(zhuǎn)變成酸，維多利亞藍(lán)B遇酸變藍(lán)。所以可以根據(jù)所產(chǎn)生的變色圈的大小來判斷其產(chǎn)脂肪酶的能力。圖中變色圈的大小表示不同菌株產(chǎn)脂肪酶的能力，變色圈越大說明其產(chǎn)脂肪酶的能力越強(qiáng)。2號變色圈最大說明其產(chǎn)脂肪酶的能力最強(qiáng)。

3.2.2 滴定法

由于透明圈法只能定性測定脂肪酶酶活，不能定量，因此采用滴定法進(jìn)行定量。利用脂肪酶可以分解脂肪產(chǎn)生酸，用0.05mol/L的氫氧化鈉滴定，同時用酚酞作為指示劑。當(dāng)指示劑由無色變成粉紅說明到達(dá)到滴定終點。對篩選出來的6株具有較大透明圈的菌株在不同溫度（20、30、40、50、60℃）、不同pH（7、7.5、8、8.5、9、9.5、10）下進(jìn)行實驗，同時作平行實驗。共測定5次。酶活最高的一株到達(dá)7.2U。然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在同樣的情況下測定3次酶活，最高的一株活性達(dá)到12U。酶活的計算如下列公式如下。

式中：V—樣品所消耗堿的體積，mL；

V0—空白對照所消耗堿的體積，mL；

t—反應(yīng)時間，min；

50—1 mL0.05mol/L氫氧化鈉的微摩爾數(shù)；

n—稀釋倍數(shù)。

3.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

3.3.1 酶最適作用溫度

酶都有其最適的反應(yīng)溫度，因而在不同溫度下酶所表現(xiàn)的活性也不同。溫度對酶促反應(yīng)的影響表現(xiàn)為兩個方面：一是，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度升高時，反應(yīng)速度加快，酶活力高。二是，由于酶是生物催化劑，是一類特殊的蛋白質(zhì)，超過一定的溫度，酶會發(fā)生變性而失活。實驗中酶液濃度相同，pH為8，溫度選擇20、30、40、50、60℃，研究溫度對酶活的影響，反應(yīng)30min，測量其在不同反應(yīng)溫度下對相同底物的作用酶活。實驗中用的酶是上面實驗分離得到酶活最高（12U）的脂肪酶（下同），實驗結(jié)果見圖3（見下頁）。

圖3 酶反應(yīng)的最適溫度Fig.3The optimum temperature of the enzyme reaction

由圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)溫度升高反應(yīng)速度加快，酶活力升高，當(dāng)溫度升高到50℃時，酶活力達(dá)到最大值，超過這個溫度后，酶活力開始下降。因此，50℃為脂肪酶的最適溫度。

3.3.2 酶最適作用pH

環(huán)境pH影響酶蛋白的構(gòu)象和酶分子的解離狀態(tài)，因此不同的酶具有各自的最適pH值。為了測定不同pH條件對酶活性的影響，選用堿性脂肪酶，在30℃及相同底物下，pH為7、7.5、8、8.5、9、9.5、10，反應(yīng)30min，測定脂肪酶的酶活。利用平板測定法測出酶反應(yīng)的最適pH。其原理是觀察其產(chǎn)生變色圈直徑的大小來粗測酶活性的大小。變色圈直徑越大說明酶活性越大，反之則越小。實驗結(jié)果見圖4。

圖4 酶反應(yīng)的最適pHFig.4The optimum pH of the enzyme reaction

由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，pH升高，反應(yīng)速度加快，酶活力升高，當(dāng)pH升高到8.5時，酶活力達(dá)到最大值，超過這個pH后酶活力開始下降。

3.3.3 酶的最適反應(yīng)時間

酶反應(yīng)過程中達(dá)到最高活力需要一段時間。不同酶在相同的底物濃度、溫度、pH的條件下，測量不同反應(yīng)時間（5、10、15、20、25、30、35min），酶活的大小，研究該脂肪酶達(dá)到最高點所需的時間。這對酶在生產(chǎn)應(yīng)用中時間的控制有一定的影響。在不同反應(yīng)時間下對所篩出的脂肪酶進(jìn)行了比較。

圖5 反應(yīng)時間對脂肪酶活力的影響Fig.5The influence of reaction time for Lipase activity

由圖5可以看出，在一定反應(yīng)時間內(nèi)隨時間延長，酶活力升高，當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到15min時酶活力達(dá)到最大值，隨后酶活力開始下降。

3.3.4 穩(wěn)定時間對酶活的影響

反應(yīng)終止后體系并沒有穩(wěn)定，反應(yīng)尚未結(jié)束，需要一段時間才能達(dá)到平衡。酶在30℃、pH8.5的條件下反應(yīng)30min后終止，然后間隔不同的靜置時間后測定酶反應(yīng)液的酶活。

圖6 穩(wěn)定時間對脂肪酶活力的影響Fig.6The influence of standing time for Lipase activity

由圖6可知，在一定穩(wěn)定時間內(nèi)隨時間的推移，酶活力升高，當(dāng)穩(wěn)定時間達(dá)到10min時，酶活力達(dá)到最大值，超過這個穩(wěn)定時間后酶活力開始下降。

3.4 菌種鑒定

通過對所篩出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行革蘭氏染色和普通的細(xì)菌染色法最終確定該菌菌種，其顯微鏡照片顯示為革蘭氏陰性短桿菌，如圖7（見下頁）所示。

4 討論

本文通過篩選到了預(yù)期的產(chǎn)脂肪酶的菌株，而且產(chǎn)量較高。特別是通過對篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，其產(chǎn)酶活性有了很大的提高，酶活達(dá)到12U。進(jìn)一步的優(yōu)化培養(yǎng)將在后續(xù)的工作中進(jìn)行。

對脂肪酶酶活的測定是一個比較困難的問題，測定結(jié)果與底物的種類、底物的形態(tài)、體系的pH、溫度、反應(yīng)時間和穩(wěn)定時間都有關(guān)系。除了上述影響條件以外，還有PVA的聚合度、乳化液制備的攪拌速度及終止劑等因素。需要以后進(jìn)一步研究。

本文只對菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察，采用生理生化及16sRNA方法鑒定正在進(jìn)行中，有望篩選到一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的脂肪酶產(chǎn)生菌。

[1]孫宏丹,孟秀香,賈莉,等.微生物脂肪酶及其相關(guān)研究進(jìn)展[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2001,(23):293-295.

[2]盧世珩,劉光燁,江躍林,等.合成己酸乙酯脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件[J].微生物學(xué)通報,1994,(21):23-26.

[3]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:北京科學(xué)出版社,2001,(22):128.

[4]李江華,鄔敏辰,鄔顯章,等.圓弧青霉PG37堿性脂肪酶的發(fā)酵工藝條件[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,2000,19(2):100-104.

[5]施巧琴.堿性脂肪酶的研究[J].微生物學(xué)通報,1988,8(3): 108-110.

[6]陶文沂.微生物脂肪酶[D].無錫:無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1998, (17):22-26.

[7]Daniel,Prieur.Microbiology of deep 2 sea hydrothermal vents[J]. Marine Biotechnology,1997,(15):242-244.

[8]李建武,余端元,袁明秀.生物化學(xué)實驗原理和方法[M].北京:北京大學(xué)出版社,311-312.

[9]鄭建豐,鄔敏辰.堿性脂肪酶測定方法的研究[J].江蘇食品與發(fā)酵,1996,(4):8-11.

[10]中國科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組.一般細(xì)菌常用鑒定方法[J].北京:科學(xué)出版社,1978,(2):7-8.

Screening of Lipase Producing Strain

LIU Jun-jie LIU Qian CHEN Xiao-ning JIANG Jun-hui
(Shandong Lvye Pharmaceutical Co.,Ltd.,Yantai 264003,China)

The main research aspects and results are as following:First,6 strains producing lipase were isolated from 10 soil samples by enrichment culture,plate streaking and fermentation.Second,the properties of lipase were studied,after fermentation under the medium including 1.5%glucose,0.7%(NH4)2SO4,0.1%K2HPO4,1.25%beef cream,0.211% MgSO4·7H2O,1.41%olive oil and the conditions 250r/min,30℃and 72h.The optimum reaction temperature,pH,reaction time were 50℃,8.5 and 30min respectively.Finally,the isolated strain was conserved and identified by using conventional methods for bacteria identification.

Microorganism;lipase;screening

X172

A

1008-1038(2015)04-0033-06

2014-10-25

劉俊杰（1984—），男，助理工程師，研究方向為菌種篩選