羅小芳，茹清靜

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州310005）

代謝組學是一種新型的、整體性的分析技術，即應用現(xiàn)代分析儀器，對生物體體液中的內源性代謝產物進行定性與定量的分析研究，獲得特征性的代謝標志物，從而揭示生物體在某一特定環(huán)境下的基因調控功能。肝臟是機體代謝的樞紐，承當了機體大部分的合成、分解和轉化等代謝過程。故從代謝的角度研究肝臟和肝臟疾病很重要。

1 代謝組學的概況

1.1 代謝組學的概念和特點

代謝組學是晚近興起的后基因組學，是生命科學最熱門的研究領域之一。代謝組學（Metabonomics）的概念，由英國倫敦大學Nicholson 博士在1999 年首次提出，它被定義為代謝物質動態(tài)響應的定量測定和定性分析，如病理生理、遺傳修飾的生物體和外界的刺激導致的改變等[1]。2000 年，德國馬普所的Fiehn 教授[2]等提出了metabolomics 的概念，將代謝組學界說為一個靜態(tài)的過程，即對生物樣品的整體代謝譜研究是在特定條件下進行的。近年來，隨著探究的深入，科學家們對其概念也進行了完善和增補，將代謝組學定義為：通過分析生物體的體液、組織中內源性小分子代謝產物的變化，獲取生物標記物，從而揭示不同時間與環(huán)境下的生物體整體功能狀態(tài)的差異[3]。

代謝組學來源于代謝組[4]，是以組群指標分析為基礎，以數(shù)據處理為手段，以信息建模整合為目標，通過對機體代謝產物在時間上的定量和定性分析，從總體上評價生命體的功能狀況及其改變[5]。與其他組學相比較，基因和蛋白質表達的有效微細變化會在代謝產物上得到放大，便于檢測，代謝物含量的微細變化與生物表型的大改變是可以有直接相關性的[6]，如Billy David 曾言：“基因組學和蛋白質組學告訴你可能發(fā)生什么，而代謝組學則告訴你已經發(fā)生了什么?！盵7]

1.2 代謝組學的研究方法

代謝組學的研究程序一般包括生物樣本的采集，樣品預處理，數(shù)據的收集、剖析與詮釋，符號識別和路徑分析等環(huán)節(jié)[8]。關鍵的環(huán)節(jié)是數(shù)據的分析和處理[9]，常用的方法是核磁共振（NMR），質譜（MS）及其聯(lián)用技術：①NMR 技術，作為結構分析的有力工具，它可以快速無創(chuàng)、無偏向性地對生物體液等復雜混合物進行檢測，樣品不需要繁瑣處理，多種成分測定可同步進行[10]。NMR 的局限性在于其靈敏度相對較低，檢測動態(tài)范圍有限，故不適合用于分析數(shù)量較大的低濃度代謝物。②MS 技術[11]，單獨運用時速度較快，與其他技術聯(lián)合使用則具有高靈敏度、高選擇性、可定性定量分析多種代謝物等性質，現(xiàn)已經成為代謝組學研究中的首選技術。氣相色譜-質譜（GC-MS）[12]，能同時測定上千種不同化合物的化學性質，具有較高的檢測靈敏度，我們還能參考其提供的質譜庫來確定待分析樣品的代謝成分。最大的好處是，不需要那些非揮發(fā)性代謝產物的化學衍生化過程尤其適用于那些物質熱穩(wěn)定性差，難揮發(fā)和相對分子質量較大的物質；毛細管電泳-質譜（CE-MS）[13]，這是一個相對較新且具有發(fā)展前景的技術，其優(yōu)勢在于高分離效率和微量樣本量，故可以同時得到不同類代謝物的不同的代謝組學特征。

2 代謝組學在肝臟疾病研究中的應用

作為機體代謝的重要器官，肝臟承擔了大部分的合成、分解和轉化等過程，一些酶和功能是肝臟所特有的；肝臟一旦受損，將影響全身各個系統(tǒng)器官的功能，因此從代謝的角度研究肝臟疾病，有其物質基礎[14]。故在肝臟疾病研究中具有不可或缺的作用。

2.1 代謝組學在乙型肝炎中的應用

全球人口中約有20 億人感染乙型肝炎病毒，其中20%～35%的患者最終將死于肝硬化或肝癌[15]。楊永霞等[16]利用超導核磁共振譜儀分別檢測8 例正常人血清和11 例重型乙型肝炎患者血清，發(fā)現(xiàn)重癥肝患者的蛋氨酸、三甲胺和葡萄糖含量升高，而乳酸、膽堿和脂質的含量降低。這些血清代謝物的差異可以幫助我們對重癥乙肝患者的早期識別、診斷及治療，提高預后生存率。侯麗娟等[17]采用NMR技術檢測慢性乙肝合并抑郁患者的尿液中的代謝物質，發(fā)現(xiàn)慢乙肝合并抑郁的患者尿液中乙酸鹽、馬尿酸鹽和二甲基甘氨酸的含量顯著升高，本研究結果有助于未來解決臨床實踐中抑郁癥診斷不確定的困境。

2.2 代謝組學在脂肪肝中的應用

非酒精性脂肪肝是一種與肥胖、胰島素抵抗及遺傳因素有關的代謝性疾病[18]，是隱源性肝硬化的最主要病因[19]，70%隱源性肝硬化由非酒精性肝炎導致[20]，肝活檢是其臨床診斷的金標準，但由于是一種有創(chuàng)技術，故臨床推廣受限。劉曉琳等[21]通過液相色譜-四級桿飛行時間質譜技術在大鼠的肝臟和血清中檢測差異表達的代謝物，結果發(fā)現(xiàn)40 只大鼠都出現(xiàn)了代謝紊亂，且硬脂酰肉毒堿在非酒精性脂肪肝的不同表型中都穩(wěn)定升高，為臨床提供了一個敏感且無創(chuàng)的診斷脂肪肝的方法。酒精性肝病[22]（Alcoholic liver disease，ALD）是由于酒精直接對肝臟細胞造成損害，引起肝細胞發(fā)生脂肪變性、壞死，孫長海等[23]用GC-MS 梁琦等[25]結合代謝組學結果檢測：確定了肌酐、氨基酸和谷胱甘肽等7 種可早期診斷酒精性肝病患者的尿液中生物標記物。

2.3 代謝組學在肝損傷中的應用

肝損藥物及其代謝產物的毒性作用、化學品及過敏反應等非病毒性因素是造成肝損傷的主要原因[24]，而臨床上對肝損傷的診斷目前主要依靠排除法。廣防己、漢防己的使用會影響涉及葡萄糖和脂質代謝的肝毒性和肝線粒體功能的影響；且涉及到能量代謝紊亂。Schoonen W[26]等發(fā)現(xiàn)用溴苯誘導肝壞死的小鼠模型，其肝壞死的程度與溴苯的劑量成正相關，處理組小鼠的血清及尿液中的乳酸鹽、酪氨酸等代謝產物的含量與對照組小鼠不同，提示我們可以通過檢測代謝產物的改變來發(fā)現(xiàn)具有特異性生物學標記物的肝損傷。

2.4 代謝組學在肝硬化中的應用

肝硬化是由一個或多個病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損害，目前代謝組學技術廣泛應用于肝硬化的診斷[27]。楊永霞等[28]等用核磁共振氫譜（1H NMR）技術研究乙肝后肝硬化患者血清的代謝組學變化，發(fā)現(xiàn)磷酸膽堿/脂和膽堿含量降低，而乳酸、甲硫氨酸及葡萄糖的含量升高，這些代謝產物的差異提供了肝硬化在可靠的分子水平上的診斷依據，可盡早區(qū)分出乙肝和乙肝后肝硬化患者，便于及時進行治療。

2.5 代謝組學在肝衰竭中的應用

肝衰竭[29]是由多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒和排泄等功能發(fā)生嚴重障礙甚至失代償，病死率極高。Yang 等[30]研究肝功能衰竭鼠模型的代謝組學特征，發(fā)現(xiàn)肝功能衰竭組與對照組之間的血清膽汁酸峰值有明顯差異，提示血清膽汁酸水平可以為肝衰竭的病因分析及進一步研究提供依據。Feng 等[31]應用CG-MS 研究了急性肝功能衰竭大鼠的血清代謝產物，發(fā)現(xiàn)血清中β-羥丁酸鹽、5-羥吲哚乙酸和磷酸鹽含量水平均增高，提示代謝產物的變化能幫助急性肝功能衰竭的診斷。

2.6 代謝組學在原發(fā)性肝癌中的應用

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）目前發(fā)病率位居惡性腫瘤第5 位，病死率居第3 位[32]，同時它的5 年生存率還不到7%[33]。甲胎蛋白（AFP）不是原發(fā)性肝癌獨有的客觀輔助指標，鑒于AFP 的非特異性，張蕾等[34]選擇27 例肝癌患者、31 例肝硬化患者及22 例健康志愿者的尿液樣本，采用超高效液相色譜與質譜聯(lián)用技術進行代謝組學的分析研究，結果發(fā)現(xiàn)四氫醛固酮3 葡萄糖甘酸、膽汁甘氨酸等代謝物在肝癌組尿液中含量高于肝硬化組，而鵝脫氧膽酸、乳果糖、吡啶酚等代謝物的含量均低于肝硬化組，這些代謝標志物的變化可以為原發(fā)性肝癌的發(fā)病機理及早期診斷提供重要的分子學依據。

2.7 代謝組學在肝移植中的應用

肝移植是治療各種終末期肝臟疾病的主要手段。因為肝移植術前、術后患者易發(fā)生多器官的生理功能障礙和代謝代謝紊亂，故及時準確地監(jiān)測病情變化，是患者能否實施肝移植和評估移植肝功能狀態(tài)的關鍵。有相關肝移植的研究[35]表明，許多重要的生物標記物都與尿素代謝循環(huán)有關，如供肝者肝中甲基化精氨酸衍生物的濃度可以靈敏地預測移植肝的功能狀態(tài)，而血清和尿液中的尿素異常降低、谷氨酰胺異常升高的水平均可以用來判斷是否出現(xiàn)肝移植腎功能異常及急性排異反應。

3 小結與展望

代謝組學技術正處于快速發(fā)展的階段，能全面評估細胞在其自身微環(huán)境中的狀態(tài)，具有巨大的應用潛力和科學價值，其在肝臟疾病中的應用范圍也越來越廣泛。我們有理由相信，隨著代謝組學技術的進一步革新及分析技術的不斷完善，我們能尋找出更多特征性代謝標志物，從而為其發(fā)病機理、診斷治療提供新的客觀依據。

[1] Nicholson JK，Lindon JC，Homlmes E. Metabolomics：Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimulate via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[2] Fiehn O，Kopka J，Dormann P，et al. Metabolite profiling for plant functional genomics[J]. Nat Biotechnol，2000，18（11）：1157-1161.

[3] 王斯婷，李曉娜，王皎，等. 代謝組學及其分析技術[J]. 藥物分析雜志，2010，30（9）：1792-1795.

[4] Sweetlove LJ，F(xiàn)ernie AR. Regulation of metabolic networks：understanding metabolic complexity in the systems biology era[J]. New Phytol，2005，168（1）：9-21.

[5] Liu CX，Li C，Lin DH，et al. Significance of Metabolomics in drug discovery and development [J]. Asian J Drug Metab Pharmacokinet，2004，4（12）：87.

[6] Nobeli I，Thornton JM. A bioinformatician’s view of the metabolome[J]. Bioessays，2006，28（5）：534-545.

[7] German JB，Bauman DE，Burrin DG，et al. Metabolomics in the opening decade of the 21st century：building the roads to individualized health [J]. Nutr，2004，134 （10）：2729-2730.

[8] 許國旺，路鑫，楊勝利，等. 代謝組學研究進展[J]. 中國醫(yī)學科學院學報，2007，29（6）：701-702.

[9] Nicholson JK，Connelly J，Lindon JC，et al. Metabolomics：a platform for studying drug toxicity and gene function[J]. Nat Rev Drug Discov，2002，1（2）153-157.

[10] Rooney OM，Troke J，Nicholson JK，et al. High-resolution diffusion and relaxation edited magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver tissue [J]. Magn Reson Med，2003，50（7）：925-927.

[11] 盧紅梅，梁逸曾. 代謝組學分析技術及數(shù)據處理技術[J].分析測試學報，2008，27（3）：326-332.

[12] 李灝，姜穎，賀福初，等. 代謝組學技術及其在臨床研究中的應用[J]. 遺傳，2008，30（4）：391-392.

[13] Soga T，Ohashi Y，Ueno Y，et al. Joumal of Proteome Research[J]. J Proteome Res. 2003，2（5）：488-491.

[14] 劉歡，韓濤. 代謝組學及其在肝臟疾病研究中的應用進展[J]. 實用肝臟病雜志，2008，11（1）：60-61.

[15] EI-Serag HB. Epidemiology of viral hepatitis and hepatocellular carcinoma [J]. Gastroenterology，2012，142（6）：1264-1273.

[16] 楊永霞，陳書峰，陳阿麗，等. 重癥乙型肝炎患者血清代謝組研究[J]. 中國抗生素雜志，2011，36（3）：220-222.

[17] 侯麗娟，許清玉，段樹鵬，等. 尿液代謝組學診斷乙肝患者的抑郁癥狀[J]. 上海交通大學學報，2014，34（11）：1647-1651.

[18] 李萌，吳濤，季光，等. 代謝組學在中醫(yī)藥治療非酒精性脂肪肝研究中的應用[J]. 世界華人消化雜志，2015，23（7）：1044-1045.

[19] Poonawala A，Nair SP，Thuluvath PJ，et al. Prevalence of obesity and diabetes in patients with cryptogenic cirrhosis：a case-control study[J].Hepatology，2000，32（5）：689-692.

[20] Caldwell SH，Oelsner DH，Iezzoni J，et a1. Cryptogenic cirrhosis：clinical characterization and risk factors for underlying disease[J]. Hepatology，1999，29（13）：664-669.

[21] 劉曉琳，明雅南，張靜怡，等. 非酒精性脂肪性肝病不同表型的代謝組學研究[J]. 肝臟，2015，20（2）：95-100.

[22] 周云飛，陳偉軍. 酒精性脂肪肝流行病學調查[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2001，17（9）：732-734.

[23] 孫長海，陳百慧，王蒙，等. 酒精性肝病患者尿液代謝組學研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2013，36（5）：44-45.

[24] 孔明，戴菁，孫旖，等. 藥物性肝損傷生物標志物研究進展[J]. 中國新藥雜志，2013，22（3）：290-293.

[25] 梁琦，倪誠，顏賢忠，等. 廣防己、粉防己的肝腎毒性及代謝組學比較研究[J]. 中國中藥雜志，2010，35（21）：2882-2888.

[26] Schoonen W，Lioks C，Ploem JP，et al.Sensitivity of 1H NMR analysis of rat urine in relation to toxico-metabonomics.Part 1：Dose dependent toxic effects of bromobenzene and paracetamol[J].Toxicol Sci，2007，98（3）：272-283.

[27] 郭孜，王文玉，戴建玉，等. 乙肝后肝硬化證候的尿代謝組學研究[J]. 世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14（1）：1282-1286.

[28] 楊永霞，楊生義，梁敏鋒，等.乙肝后肝硬化患者血清代謝組的核磁共振[J].廣東藥學院學報，2010，26（1）：99-101.

[29] XU Bin，WANG Hai long，WEI Kai hua，et al. Metabonomics analytical techniques and their applications in the study of serious and fatal diseases [J]. Journal of Instrumental Analysis，2006，25（5）：128-133.

[30] Yang L，Xiong A，He Y，et al. Bile acids metabonomlic study on the CCl4-and alpha-naphthylisothiocyanate—induced animal models：quantitative analysis of 22 bile acids by ultraperformance liquid chromatography -mass spectrometry[J]. Chem Res Toxicol，2008，21（12）：2280-2288.

[31] Feng B，Wu S，Lv F，et al. Metabolic profiling analysis of a D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced mouse model of fulminant hepatic failure[J]. J Proteme Res，2007，6（6）：2161-2168.

[32] El-Serag HB，Rudolph L. Hepatocellular carcinoma：Epidemiology and molecular carcinogenesis[J]. Gastroenterology，2007，132（7）：2557-2559.

[33] Kassahun WT，F(xiàn)angmann J，Harms J，et al. Liver resection and transplantation in the management of hepatocellular carcinoma：a review [J]. Exp Clin Transplant，2006，4（2）：549-558.

[34] 張蕾，范志娟，張磊，等. 肝細胞肝癌患者尿液代謝輪廓分析及潛在生物標志物篩選[J]. 實用檢驗醫(yī)師雜志，2012，4（2）：73-78.

[35] Martin-Sanz P，Olmedilla L，Dulin E，et al. Presence of methylated arginine derivatives in ortho topic human liver transplantation：relevance for liver function [J]. Liver Transpl，2003，9（1）：40-47.