楊　逸(綜述)，王志剛(審校)

(上海交通大學附屬第六人民普外科，上海 200233)

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胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌瘤相關(guān)微RNA的研究進展

楊逸△(綜述)，王志剛※(審校)

(上海交通大學附屬第六人民普外科，上海 200233)

摘要：微RNA(miRNA)是一類具有21～22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過程。miRNA具有促癌或抑癌作用，在人類腫瘤的起源與演進過程中起重要作用，充當促癌基因或者抑癌基因作用，是極具敏感性的生物標志物及治療靶點；相較正常組織，miRNA在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌瘤中亦存在顯著差異表達，具有潛在臨床價值。

關(guān)鍵詞：微RNA；神經(jīng)內(nèi)分泌瘤；胃腸道；胰腺

神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(neuroendocrine tumors，NETs)是一類起源于內(nèi)胚層神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的腫瘤，以胃腸胰NETs(gastroenteropancreatic NETs，GEP-NETs)最常見，發(fā)病率逐年上升[1]。GEP-NETs具有廣泛的異質(zhì)性，胃、腸、胰各部位NETs樣本量相對不足，導致GEP-NETs的基因?qū)W研究未取得突破性進展，同時很多陰性試驗提示包括p53、RB1、KRAS等在實體腫瘤中經(jīng)典的抑癌或促癌基因，在GEP-NETs中卻少有明顯改變[2-5]。微RNA(microRNA，miRNA)是廣泛存在于真核生物中的非編碼小分子RNA，自1993年發(fā)現(xiàn)以來[6]，截止2014年6月，已有28 645種miRNA被miRBase數(shù)據(jù)庫收錄。miRNA扮演促癌或者抑癌基因的角色，通過負性調(diào)控各自相應(yīng)的抑癌或促癌基因，參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展[7]。miRNA參與GEP-NETs起源和進展，并有望成為GEP-NETs診治過程中重要的生物標記及治療靶點。現(xiàn)就GEP-NETs相關(guān)的miRNA研究進展及臨床應(yīng)用前景進行綜述，以期為GEP-NETs的基礎(chǔ)研究及臨床診治提供新思路。

1miRNA概述

在細胞核內(nèi)，編碼miRNA的基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，轉(zhuǎn)錄為長鏈初始miRNA(primary miRNA,pri-miRNA)[8]。研究認為，編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄為單順反子或多順反子信使RNA(mRNA)，且其轉(zhuǎn)錄受到組織特異性主基因的控制，從而保證了miRNA的組織特異性[9]。pri-miRNA經(jīng)RNaseⅢ內(nèi)切酶家族的Drosha酶及其輔助因子DiGeorge綜合征危象區(qū)基因8(DGCR8)識別和切割，生成具有70～90個核苷酸和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體RNA(precursor RNA，pre-RNA)[10]。pre-RNA在RNA-GTP依賴的輸出蛋白Exportin-5作用下，從細胞核運輸?shù)郊毎|(zhì)，由對雙鏈RNA專一的RNA內(nèi)切酶Dicer酶剪切成長度為21～22個核苷酸的成熟雙鏈miRNA(miRNA/miRNA*)[11]。雙鏈miRNA(miRNA/miRNA*)繼續(xù)在Dicer酶的作用下解螺旋，其中一條鏈(miRNA)結(jié)合到RNA誘導的基因沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，形成非對稱RISC，RISC結(jié)合到目標mRNA上，通過與特定靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)完全或不完全互補配對，導致靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯，從而發(fā)揮其對靶基因表達的調(diào)控作用[8,12]。以往將雙鏈中與RISC結(jié)合的那條鏈稱作主鏈即miRNA，而所謂的miRNA*在miRNA結(jié)合后通常被降解，被視為無功能鏈。但越來越多的研究表明，miRNA*不是miRNA 生成過程中一條簡單的無功能鏈，它更傾向于作為一條功能鏈并起重要的生物學作用[13]。研究顯示，miRNA 對基因表達的作用機制遠比目前預期的復雜。miRNA可通過向富含AU序列的mRNA招募蛋白復合物增加靶基因的轉(zhuǎn)錄；或者與阻礙基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)相互作用，去除靶基因所受的轉(zhuǎn)錄抑制，從而間接增加靶蛋白的合成[8,14-15]。此外，部分研究還指出miRNA可通過增強核糖體生物活性促進蛋白質(zhì)合成，或者在細胞周期停滯的情況下，將其對mRNA的抑制作用轉(zhuǎn)換為激活作用，促進靶基因的轉(zhuǎn)錄[14,16]。

2miRNA與人類腫瘤

2002年Calin等[17]首次提出了miRNA與人類腫瘤相關(guān)，他們在研究慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)時發(fā)現(xiàn)，CLL患者常發(fā)生染色體13q14丟失。此染色體片段為非編碼基因DLEU2內(nèi)含子區(qū)域，但具有表達miR-15a和miR-16-1的編碼基因，多數(shù)CLL患者出現(xiàn)miR-15a/16-1的表達下調(diào)或缺失，提示其表達與CLL相關(guān)。后續(xù)研究顯示miR-15a/16-1下調(diào)原癌基因Bcl-2的表達，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤增殖，miR-15a/16-1在CLL中扮演抑癌基因的角色[18]。miR-15a/16-1抑癌基因的作用還體現(xiàn)在包括小細胞肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中，它的下調(diào)或缺失解除了其對原癌基因Bcl-2、BMI1、CCND2及CCND1等的抑制作用，導致腫瘤細胞增殖及疾病進展[19]。

近年來大量研究顯示，類似miR-15a/16-1，在正常組織中高表達，在腫瘤組織中低表達或缺失的呈抑癌基因作用的miRNA有miR-34/122/375等；而miR-21/155/195/221等在正常組織中低表達或不表達，在腫瘤組織中高表達，呈現(xiàn)促癌基因作用[17-23]。值得注意的是，miRNA具有明顯的組織細胞特異性，相同的miRNA在不同的腫瘤中作用各不同。miR-191 促進A549細胞生長而抑制海拉細胞生長，miR-24促進海拉細胞生長卻抑制A549細胞的生長[24]。miR-21通過下調(diào)第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的表達在人肝細胞肝癌中呈現(xiàn)促癌基因功能，但其在人類紅白血病中抑制癌基因KIT的表達扮演抑癌基因角色[8,25]。

3miRNA與GEP-NETs

受制于GEP-NETs臨床樣本不足及細胞株的匱乏，miRNA 在GEP-NETs中的研究報道相較其他腫瘤顯得十分稀少，目前的研究多集中于胰腺NETs(pancreatic NETs,pNETs)及小腸NETs。Roldo等[26]對正常胰腺組織、胰島組織、pNETs組織及胰腺腺泡細胞腫瘤組織進行miRNA表達譜分析，結(jié)果顯示胰腺腫瘤組織較非腫瘤組織miRNA103/107明顯上調(diào)，同時伴miRNA-155缺失或下調(diào)；pNETs同腺泡細胞癌相比，包括miR-125a/99a/99b/125b-1/342/130a/132/129-2/125b-2在內(nèi)的10個miRNA顯著差異表達。他們認為,上述差異有助于鑒別腫瘤與非腫瘤以及pNETs與胰腺腺泡上皮來源的腫瘤。另外，miR-204在胰島素瘤中特異性高表達，且與胰島素的表達密切相關(guān)；miR-21與Ki67指數(shù)及肝轉(zhuǎn)移高度相關(guān)[26]。Ruebel等[27]研究發(fā)現(xiàn),miR-133a在小腸NETs從原發(fā)到轉(zhuǎn)移的進程中，出現(xiàn)相應(yīng)的表達下調(diào)，表明其在疾病進展過程中有重要作用。Li等[28]針對小腸NETs中miRNA表達情況的研究顯示，在小腸NETs進展過程中miR-96/182/183/196/200出現(xiàn)顯著上調(diào)。上述這些miRNA被認為是pNETs或小腸NETs潛在的分類和預后判斷標志物，對它們進行深入研究，闡明其作用機制和表達變化情況，并制訂可行的臨床檢測策略，將明顯提高pNETs或小腸NETs的檢出率，以及預后判斷的準確性。一項針對結(jié)腸腺癌與正常結(jié)腸黏膜miRNA 差異表達的研究中，涉及1例結(jié)腸NETs樣本，發(fā)現(xiàn)包括miR-96在內(nèi)的38個miRNA在結(jié)腸NETs中較正常黏膜顯著上調(diào)，且其中僅有6個miRNA在腺癌中出現(xiàn)上調(diào)，這提示miRNA的表達檢測可能有助于鑒別結(jié)腸NET與腺癌。該研究中上調(diào)的部分miRNA(miR-96/182/196a/488)在Li等[29]的研究中也出現(xiàn)了上調(diào)[28]，這些miRNA有望成為GEP-NETs深入研究的對象。但需要注意的是，該研究僅涉及1例結(jié)腸NET樣本，大樣本量的后續(xù)研究十分必要。

4miRNA與臨床實踐

4.1miRNA輔助診斷研究表明，新鮮組織、石蠟樣本、血漿和血清乃至尿液和唾液均可用于檢測miRNA表達情況，這使其具有很好的臨床實用性[13]。miRNA僅有21～22個核苷酸，相比DNA或mRNA而言，其在體內(nèi)外均具有明顯的長期穩(wěn)定性，這使運用miRNA分析技術(shù)對臨床樣本進行檢測具有很好的敏感性和穩(wěn)定性，即使在石蠟樣本中，miRNA分析依然具有相當高的敏感性。Nuovo等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在石蠟樣本上進行原位雜交檢測，可在細胞或者亞細胞水平顯示miRNA的表達情況，這使miRNA檢測有望成為臨床病理學診斷的輔助工具。

miRNA的一項重要特點是具有類似于內(nèi)分泌激素的特性，它與核仁磷酸蛋白1等RNA結(jié)合蛋白一起，經(jīng)包裝與轉(zhuǎn)運，以外分泌小體或者突觸小泡的形式被運出細胞，成為循環(huán)miRNA，經(jīng)血液循環(huán)及受體細胞內(nèi)吞作用，與胞內(nèi)蛋白結(jié)合，從而作用于周邊細胞或機體遠隔部位[8,31-33]。循環(huán)miRNA具有很高的穩(wěn)定性和抗性，易于收集和儲存，使其作為生物標志物服務(wù)于臨床檢測成為可能[25]。檢測血漿或血清中的特異性miRNA表達情況有助于腫瘤的診斷；部分循環(huán)miRNA的表達水平同某些腫瘤的抗藥性相關(guān)聯(lián)，監(jiān)測這些miRNA有助于判斷患者對抗腫瘤藥物的敏感性和耐藥情況[19,25]。Matthaei等[34]將胰腺腫瘤囊內(nèi)液作為分析樣本，研究miRNA的表達譜，他們指出9個miRNA( miR-24/30a-3p/18a/92a/342-3p/99b/106b/142-3p/532-3p)的特征性差異表達可用以鑒別pNETs與胰腺的其他腫瘤(如導管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤等)。Li等[35]分析慢性胰腺炎患者、胰腺腺癌患者、pNETs患者和健康人群的血清循環(huán)miRNA表達譜，指出miR-1290的下調(diào)對于鑒別pNETs和腺癌極具參考價值。

4.2miRNA輔助治療miRNA在腫瘤中的差異表達及其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因表達所表現(xiàn)的抑癌或促癌功能，使其成為腫瘤治療的潛在生物靶點[36]。目前基于miRNA的治療策略大體分為兩類：通過轉(zhuǎn)染或直接導入人工合成的miRNA，使有抑癌基因特性的miRNA表達上調(diào)，從而抑制腫瘤的生長；應(yīng)用與特異miRNA互補的反義小分子核苷酸與相應(yīng)的miRNA結(jié)合，來沉默或競爭與mRNA的結(jié)合，使有癌基因特性的miRNA功能得以阻斷，從而抑制腫瘤的生長[37-38]。Kota等[39]通過腺病毒感染給肝癌模型小鼠全身給予miR-26a后發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯減小。Lanford等[40]研究證實，在小鼠或者靈長類動物中通過全身給予反miR-122的寡聚核苷酸可以改變肝臟脂類代謝以及減少乙型肝炎病毒的復制，從而減輕肝臟損傷，且無明顯不良反應(yīng)。隨后，他們開展了首例基于miRNA治療策略的臨床試驗(miravirsen or SPC3649)。

5小結(jié)

目前，早期診斷及手術(shù)切除是GEP-NETs的最佳診治策略。因此，針對miRNA作為GEP-NETs診斷標志物和治療靶點的研究極具臨床前景。當前，GEP-NETs相關(guān)miRNA的基礎(chǔ)及臨床研究仍不足，主要面臨的問題有：GEP-NETs起源及演進機制有待研究闡明；miRNA作用機制尚未完全闡明，miRNA與靶基因之間多對多的關(guān)系，使得完整揭示其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較困難；如何安全有效地使用miRNA類似物或其反義核苷酸治療腫瘤仍需進一步研究。相信，隨著這些問題的逐步解開，miRNA必將為GEP-NETs的研究及診治注入新的活力。

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Research Progress and Clinical Application of miRNAs in Gastroenteropancreatic Neuroendocrine TumorsYANGYi,WANGZhi-gang.(DepartmentofGeneralSurgery,ShanghaiJiaotongUniversityAffiliatedSixthPeople′sHospital，Shanghai200233,China)

Abstract:MicroRNAs(miRNAs) are a family of 21-22 nucleotides,non-coding small RNAs that function as posttranscriptional gene regulators.They are involved in critical biologic processes including proliferation,differentiation and apoptosis.A myriad of studies have demonstrated that miRNAs can act as tumor-suppressors or oncogenes in the origin and progress of human neoplasms.Aberrant miRNA expression can be a sensitive hallmark and therapeutic target.It is reported that aberrant miRNA expression is also occurred in the development and progress of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors,which is of potential clinical value.

Key words:MicroRNA; Neuroendocrine tumor; Gastrointestinal tract; Pancreas

收稿日期：2015-01-19修回日期：2015-03-30編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.015

中圖分類號：R656; R735

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)21-3883-04