全　瑤，張素紅(綜述)，黃　婷(審校)

(南京市高淳人民醫(yī)院兒科，南京 211300)

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人類博卡病毒的研究進(jìn)展

全瑤※，張素紅(綜述)，黃婷(審校)

(南京市高淳人民醫(yī)院兒科，南京 211300)

摘要：人類博卡病毒(HBoV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科的博卡病毒屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的繼細(xì)小病毒B19之后能感染人的第二類細(xì)小病毒?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的HBoV可分為HBoV-1、HBoV-2、HBoV-3和HBoV-4四型。研究顯示，HBoV在不同類型的標(biāo)本中均有檢出，檢出率差異較大，且較多合并其他病原體的檢出。現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，HBoV不僅可能是呼吸道疾病的致病原，也有可能是胃腸道疾病的致病原。

關(guān)鍵詞:人類博卡病毒；生物學(xué)性狀；致病性；檢測方法

2005年8月，瑞典科學(xué)家Allander等[1]對兒童急性上呼吸道感染樣本進(jìn)行大規(guī)模篩查時，發(fā)現(xiàn)一種與已知的細(xì)小病毒類似的新病毒，因其與牛和犬博卡病毒同源性很高，故將其命名為人類博卡病毒(human Bocavirus，HBoV)。2009年1月Kapoor等[2]從非脊髓灰質(zhì)炎感染急性弛緩性麻痹患兒糞便中發(fā)現(xiàn)HBoV2，其后HBoV3[3]和HBoV4[4]也相繼被發(fā)現(xiàn)。在分類學(xué)上，認(rèn)為HBoV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科的博卡病毒屬，HBoV是迄今發(fā)現(xiàn)的繼細(xì)小病毒B19之后能感染人的第二類細(xì)小病毒。根據(jù)HBoV的全基因組測序和序列分析結(jié)果，HBoV可分為HBoV1、HBoV2、HBoV3和HBoV4四型。目前尚未確定4種HBoV代表不同的病毒株，還是一種病毒株的不同基因型?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，HBoV不但是呼吸道疾病的致病原，也有可能是引起小兒急性胃腸炎的致病原[5]。現(xiàn)對HBoV的生物學(xué)性狀、流行特征、疾病相關(guān)性、檢測方法等方面予以綜述。

1HBoV的分子生物學(xué)特征

HBoV基因組為單鏈線性DNA，全長約為5.6 kb，形態(tài)與其他細(xì)小病毒十分相似，是一類無包膜的小顆粒病毒，電鏡下顆粒直徑為20～25 nm[6]。4型HBoV基因組結(jié)構(gòu)基本一致，從5′～3′有3個開放讀碼區(qū)，其中2個開放讀碼區(qū)分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NP1，另1個開放讀碼區(qū)編碼兩種病毒衣殼蛋白VP1和VP2。VP1與VP2具有典型的基因重疊區(qū)，此外，VP1還具有非重疊區(qū)即VP1獨特區(qū)(VP1u)[7]。5′端left-end hairpin(LEH)及3′端right-end hairpin(REH)具有回紋序列，形成莖環(huán)、發(fā)卡樣復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)[8-11]。

細(xì)小病毒NS1基因最早被轉(zhuǎn)錄、翻譯，經(jīng)證實其在病毒復(fù)制過程中起到超激活的作用[12-15]；非結(jié)構(gòu)蛋白NP1與病毒復(fù)制有關(guān)，并且在逃避宿主固有免疫中發(fā)揮重要作用[15]。HBoV VP1有磷脂酶A2樣活性，對病毒感染人體起著重要作用，能幫助病毒從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[16-17]。VP1、VP2基因比較保守，VP1、VP2蛋白具有良好的抗原性，因此常用于HBoV的血清學(xué)檢測[18]。有研究通過原核表達(dá)HBoV1 VP1u和VP2蛋白，利用免疫斑點技術(shù)對哮喘患兒血清進(jìn)行HBoV1 IgG及IgM檢測，結(jié)果顯示相較于VP1u，VP2有更強(qiáng)的免疫活性，證明VP2是HBoV血清學(xué)檢測的理想抗原[19]。所以目前較多的研究針對VP2結(jié)構(gòu)蛋白制作單克隆抗體，建立快速病毒檢測方法，從而能方便用于臨床工作中。

2HBoV的流行特征

2.1流行概況自Allander等[1]第一次發(fā)現(xiàn)HBoV后，世界各地均有HBoV的檢出，表明HBoV感染呈全球性分布。由于標(biāo)本的采集對象、方法、季節(jié)、保存方法、實驗技術(shù)、引物的設(shè)計及方法的敏感性及特異性不同，HBoV DNA檢出率差別較大。雖然HBoV DNA在呼吸道標(biāo)本、糞便標(biāo)本、血清標(biāo)本、尿液、腦脊液等中均有檢出，但目前HBoV DNA的檢測主要針對呼吸道及胃腸道標(biāo)本。研究顯示，在有呼吸道癥狀患者的呼吸道標(biāo)本中HBoV DNA檢出率為0.8%～19%[5-6]，在胃腸道疾病患者糞便標(biāo)本中HBoV DNA檢出率為0.8%～9.1%[2-5]。

2.2年齡分布HBoV可以感染不同年齡組人群，年齡分布從新生兒至60歲以上，其中易患人群為低年齡階段兒童,尤其是6個月至2歲的嬰幼兒。考慮6個月以下的嬰兒的感染率較低的原因，可能與母傳保護(hù)性抗體尚未消失有關(guān)；之后隨著機(jī)體自身免疫的逐漸形成，HBoV的感染率呈下降趨勢。

2.3季節(jié)分布HBoV感染高峰的出現(xiàn)沒有時間差異性，許多研究均顯示HBoV感染沒有明顯的季節(jié)性分布[20-22]。美國Kesebir等[20]報道，HBoV檢出高峰出現(xiàn)時間為1～3月和 10～12月。法國報道的流行高峰主要集中在3～4月份[21]。日本東京地區(qū)，HBoV陽性標(biāo)本大部分集中在1～5月，高峰出現(xiàn)在4～5月[22]。我國已有的研究結(jié)果也顯示，HBoV感染沒有明顯的季節(jié)分布[23]。

2.4血清流行病學(xué)Kahnd等[24]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)方法，報道人群HBoV1 IgG陽性率為72.7%，2個月以下的嬰兒和5歲以上的兒童HBoV1 IgG陽性率均>85%。成人血清HBoV1 IgG陽性率高的原因考慮可能是由于機(jī)體被HBoV1感染過后產(chǎn)生了保護(hù)免疫。年齡<6個月的嬰兒也有較高的陽性率，有學(xué)者認(rèn)為是母體抗體通過胎盤傳遞至嬰幼兒的緣故[25]。相較于HBoV1，HBoV2～4感染率及刺激B細(xì)胞克隆選擇性活化度較低。Kantola等[26]通過構(gòu)建重組病毒樣顆粒的酶免疫分析法檢測HBoV2～4抗體，成人血清流行率分別為34%、15%和2%。HBoV1～4型之間具有較高的氨基酸同源性，研究發(fā)現(xiàn)HBoV1～4主要抗原VP2蛋白之間存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，這也可能是導(dǎo)致HBoV1血清陽性率高的原因。在去除HBoV2～4抗體的影響的情況下，成人HBoV1抗體陽性率從96%降至59%。

3HBoV的疾病相關(guān)性

HBoV DNA在不同類型的標(biāo)本中均有檢出，其中HBoV1和HBoV2 DNA的檢出率最高。呼吸道標(biāo)本HBoV1 DNA檢出率較高，HBoV2 DNA主要在消化道標(biāo)本中檢出。在此主要總結(jié)HBoV感染與呼吸道疾病、胃腸道疾病以及腦炎的疾病相關(guān)性。

3.1HBoV與呼吸道疾病目前HBoV研究與呼吸道疾病的研究基本采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)或?qū)崟r熒光定量PCR檢測。主要感染對象為2歲以下嬰幼兒，臨床表現(xiàn)常以發(fā)熱、咳嗽、流涕、喘息、呼吸困難等癥狀，肺炎、支氣管炎、鼻炎、咽喉炎、哮喘的發(fā)生率也相當(dāng)高。急性呼吸道感染患者呼吸道標(biāo)本中主要檢出的基因型為HBoV1，文獻(xiàn)報道HBoV1與重癥肺疾病及兒童喘息密切相關(guān)[21]。

HBoV DNA陽性的呼吸道標(biāo)本常檢出伴有其他病原體的混合感染，常見的共感染病原體為鼻病毒、流感病毒及呼吸道合胞病毒，而且由于尚未建立成熟的體外培養(yǎng)體系及敏感的動物模型，所以有學(xué)者對HBoV的呼吸道致病性提出了質(zhì)疑[20-21]。2012年Huang等[27]通過擴(kuò)增HBoV1末端回紋序列，構(gòu)建了HBoV的全基因組，并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測出有子病毒的產(chǎn)生，同時感染原代支氣管上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了細(xì)胞病變效應(yīng)。HBoV1的感染性克隆的成功構(gòu)建，證明HBOV1可以引起呼吸系統(tǒng)病變。綜合目前的一系列的研究結(jié)果，目前考慮HBoV1與呼吸道感染有相關(guān)性。同時有研究報道無呼吸道癥狀患者幾乎無HBoV DNA檢出，同時實時熒光定量PCR檢測顯示HBoV在感染人體后，可以在呼吸道以低載量狀態(tài)長期存在，一系列的研究證實呼吸道癥狀僅與病毒的高載量在統(tǒng)計學(xué)上呈相關(guān)性[28-29]，所以關(guān)于HBoV的呼吸道致病機(jī)制尚待進(jìn)一步明確。

3.2HBoV與胃腸道疾病HBoV1 DNA在呼吸道標(biāo)本檢出較多，而HBoV2～4 DNA主要在腹瀉患兒的糞便標(biāo)本中檢出。相對于HBoV3及HBoV4，HBoV2在腹瀉患兒的糞便標(biāo)本中檢出率和遺傳差異相對較高?；颊叩闹饕憩F(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉等急性胃腸病的典型癥狀，部分患兒可伴有呼吸道癥狀。雖然目前的研究結(jié)果提示HBoV與兒童腹瀉病的關(guān)系密切[30-31]。然而尚有大量的病例對照研究結(jié)果并不完全支持這一結(jié)論，因為在健康兒童糞便標(biāo)本中也有HBoV DNA的檢出，兩者間HBoV DNA的檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而且胃腸炎患者的胃腸道標(biāo)本中常檢出輪狀病毒、杯狀病毒、星狀病毒等共感染，所以HBoV到底是胃腸道疾病的致病原還是腸道的“過路者”尚不能得出結(jié)論[32]。

3.3HBoV與腦炎的相關(guān)性2012年Mitui等[33]在4例腦炎患兒的腦脊液中檢測出HBoV DNA，基因分型顯示2例為HBoV1、2例為HBoV2，未檢測出其他病毒混合感染，并且其中1例HBoV2感染患兒出現(xiàn)了病毒血癥。2013年Yu等[34]同樣在67例腦炎患兒的腦脊液中用PCR方法檢測出10例HBoV DNA陽性，其中9例為HBoV1、1例為HBoV2。所以HBoV是否可以引起病毒性腦炎值得進(jìn)一步研究。如果能引起腦炎，HBoV又是如何透過血腦屏障進(jìn)入腦脊液或者是怎樣損害血腦屏障的問題值得下一步的探索。

4HBoV的檢測方法

關(guān)于HBoV感染診斷目前仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因為針對HBoV的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和動物模型尚不成熟，所以主要采用PCR擴(kuò)增臨床樣本的HBoV基因組進(jìn)行檢測。ELISA、免疫印跡、免疫熒光檢測的建立可進(jìn)一步用于血清中HBoV IgG和IgM抗體的檢測[19，35-36]。電鏡技術(shù)也可運(yùn)用于病毒的檢測，然而因電鏡標(biāo)本制作比較繁瑣，且價格昂貴，所以其在HBoV感染的檢測應(yīng)用中受到局限，目前主要用于病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察。

4.1分子診斷HBoV的分子診斷主要采用PCR擴(kuò)增方法。針對HBoV的不同基因，如NS1、NP1或VP1、VP2，設(shè)計特異性的引物，檢測患者呼吸道、血清、糞便及尿液等臨床樣本中的HBoV基因組。目前PCR擴(kuò)增方法主要為常規(guī)巢式PCR和實時熒光定量PCR兩種[37]。實時熒光定量PCR有檢測敏感性高、特異性好，通過熒光信號檢測可以直接對產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測，且操作簡單安全，不易產(chǎn)生污染等優(yōu)點。雖然巢式PCR費(fèi)時費(fèi)力易出現(xiàn)假陽性，但巢式PCR在檢測成本上有明顯優(yōu)勢，而且研究顯示巢式的敏感性與實時熒光定量PCR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

4.2血清學(xué)診斷雖然PCR是一項針對HBoV核酸的快速、敏感的檢測技術(shù)，但實時熒光定量PCR檢測顯示標(biāo)本中HBoV病毒載量較低，且有研究發(fā)現(xiàn)HBoV在感染人體后，可以在呼吸道以低載量狀態(tài)長期潛伏[38]，表明PCR檢測并不能明確HBoV的急性感染。血清學(xué)檢測方法可以彌補(bǔ)PCR檢測技術(shù)的不足，成為另一種重要的HBoV檢測的方法。Kantola等[26]提出了HBoV急性期感染的血清學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：含以下標(biāo)志中至少兩項：HBoV IgM抗體產(chǎn)生；HBoV IgG抗體效價4倍增高或轉(zhuǎn)換；HBoV IgG低活性；病毒血癥。血清學(xué)檢測針對HBoV的特異性抗體的產(chǎn)生、變化過程及規(guī)律，是一項可靠的急性期血清學(xué)檢測方法[39]，從而為疾病的防治提供既往感染規(guī)律、人群易感性等血清流行病學(xué)依據(jù)。

5小結(jié)

HBoV是新發(fā)現(xiàn)的一種單鏈DNA病毒，目前國內(nèi)外在HBoV的分子生物學(xué)及流行病學(xué)方面的研究已取得一定的成就。HBoV1的感染性克隆的成功構(gòu)建表明HBoV1可以引起呼吸系統(tǒng)病變，然而HBoV的胃腸道致病性尚未明確。為了解HBoV的致病性及致病機(jī)制，除了感染性克隆的構(gòu)建，篩選易操作的敏感細(xì)胞系，建立動物模型等基礎(chǔ)性工作仍需要進(jìn)一步開展，從而有助于呼吸道及胃腸道疾病的預(yù)防及治療。

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Progress in and Research of Human BocavirusQUANYao,ZHANGSu-hong,HUANGTing.(DepartmentofPediatrics,NanjingGaochunPeople′sHospital,Nanjing211300,China)

Abstract:Human Bocavirus(HBoV) is another parvovirus known to infect and cause illness in human besides Parvovirus B19. HBoV is classified as genus bocavirus in the family of Parvoviridae.So far,four different subtypes of HBoV(HBoV1-4) have been found.HBoV has been detected in different kinds of samples.The detection rate of HBoV infection varies widely,and is often co-detected with other pathogens.The existing results show that HBoV may not only be the pathogen of respiratory tract disease,but also the pathogen of gastrointestinal disease.

Key words:Human bocavirus; Biological characters; Pathogenicity； Detection method

收稿日期：2015-01-19修回日期：2015-04-23編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.009

中圖分類號：R725.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)21-3864-03