孔春明，邱麗芬，張紅梅，馬月香

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250014； 2.濟(jì)南市歷下區(qū)人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南250355）

冠心?。╟oronary artery heart disease，CHD）是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，其發(fā)病率有逐年遞增的趨勢(shì)。中醫(yī)學(xué)中沒(méi)有“冠心病”病名，依據(jù)其臨床表現(xiàn)，辨證多屬于“胸痹”“心痛”等范疇，中醫(yī)在CHD的治療方面發(fā)揮著獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。研究表明在冠心病所有的中醫(yī)辨證分型中以氣虛型所占比例最多［1-2］。對(duì)于“氣”在冠心病發(fā)病中的重要作用的認(rèn)識(shí)古已有之。如清代魏荔彤提倡胸痹的病機(jī)為“氣血凝滯”說(shuō)，論述曰：“胸痹者，痹于胸也。痹病，風(fēng)挾寒濕之邪客于分肉，本在軀殼之表，何有痹于胸者？……唯陽(yáng)氣虛極，斯氣血凝聚，遲緩膠固，所以至于胸痹而心亦痛也?！保ā督饏T要略本義》）明代汪機(jī)對(duì)于本病病因的論述曰：“未有不由氣滯而致者，古方皆用行氣散氣之劑，治而愈之。”（《醫(yī)學(xué)原理》）因此對(duì)于冠心病心氣虛的研究具有重要的意義。本研究通過(guò)對(duì)冠心病心氣虛大鼠模型進(jìn)行益氣活血方藥的干預(yù)治療，觀察各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，以探討益氣活血方藥對(duì)冠心病心氣虛大鼠模型心肌細(xì)胞凋亡的影響，為中藥治療冠心病心氣虛證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠，體重（200±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)中藥 人參、黃芪、丹參、川芎中藥飲片，均由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 試劑與儀器 石蠟切片機(jī)（德國(guó)，Leica）、石蠟包埋機(jī)（德國(guó)，Leica）、光學(xué)顯微鏡（日本，Olympus）、蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)C0105，碧云天生物技術(shù)公司提供）、小動(dòng)物呼吸機(jī)（河北醫(yī)科大學(xué)儀器廠）、手術(shù)包（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）；左旋硝基精氨酸（L-NNA，Sigma公司）、鹽酸地爾硫（天津田邊制藥有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、假手術(shù)組、西藥組，益氣活血方低、中、高劑量組，每組10只。大鼠經(jīng)10%水合氯醛250 mg/kg腹腔注射麻醉。無(wú)菌條件下氣管切開(kāi)、插管、上動(dòng)物呼吸機(jī)正壓輔助呼吸。胸部去毛，消毒，沿左鎖骨中線縱行切開(kāi)皮膚2 cm，在第四或五肋間鈍性分離肌層，打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包，輕壓右側(cè)胸廓，快速擠出心臟，在左冠狀動(dòng)脈前降支中上1/3處行結(jié)扎后把心臟放回胸腔。逐層關(guān)胸，待動(dòng)物蘇醒后拔氣管插管。24 h后以心電圖ST段下移和T波改變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)判斷其為CHD大鼠模型。術(shù)后每只大鼠每天肌注青霉素10萬(wàn)U預(yù)防感染。術(shù)后大鼠于常規(guī)喂養(yǎng)1 w后，空白組和假手術(shù)組給予生理鹽水1 mL，腹腔注射4 w。其余各組以15 mg/（kg·d）左旋硝基精氨酸分2次腹腔注射4 w［3］。造模成功后益氣活血方低、中、高劑量組分別灌服低、中、高不同濃度梯度的益氣活血中藥煎劑1.6 mL/100 g；西藥組每日按體重以30 mg/kg灌服鹽酸地爾硫 混懸液1.6 mL/100 g；空白組、假手術(shù)組、模型組以1.6 mL/100 g灌服生理鹽水。

1.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

45 d后進(jìn)行麻醉，取心肌組織，HE染色檢測(cè)結(jié)扎處心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。取心肌組織進(jìn)行固定并按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋、切片，按照蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行組織染色，觀察結(jié)扎處心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

2 結(jié) 果

空白組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，輪廓清晰，細(xì)胞核完整，胞質(zhì)均勻；假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列較為整齊，見(jiàn)少量肌細(xì)胞呈波浪狀改變，細(xì)胞間隙均勻，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞壞死，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核固縮變形甚至脫失，血管管腔增大，組織間隙明顯增寬并充填有大量纖維組織，橫紋模糊斷裂；西藥組、益氣活血方低劑量組、益氣活血方中劑量組心肌細(xì)胞變性、壞死程度較模型組有改善，血管擴(kuò)張程度減輕，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；益氣活血方高劑量組心肌細(xì)胞排列較為整齊，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯血管擴(kuò)張，纖維增生程度較模型組減輕明顯。結(jié)果見(jiàn)圖1~圖7。

3 討 論

圖1 空白組心肌組織病理特征

圖2 假手術(shù)組心肌組織病理特征

圖3 模型組心肌組織病理特征

圖4 西藥組心肌組織病理特征

圖5 低劑量組心肌組織病理特征

圖6 中劑量組心肌組織病理特征

圖7 高劑量組心肌組織病理特征

有研究表明，心肌細(xì)胞的凋亡不僅與心肌重塑有關(guān)，而且會(huì)促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展及惡化，這可能與心肌細(xì)胞的缺失有關(guān)。心肌細(xì)胞的凋亡及數(shù)量的減少會(huì)導(dǎo)致心肌收縮力的降低，進(jìn)而影響心功能［4］。有研究表明，冠心病心氣虛證與心功能的降低關(guān)系密切［5-8］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組心肌組織壞死嚴(yán)重而益氣活血方高劑量組可以改善心肌組織的壞死程度，進(jìn)而改善心功能，進(jìn)一步表明對(duì)心功能的評(píng)價(jià)與判斷可以作為冠心病心氣虛的診斷依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞壞死，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核固縮變形甚至脫失，血管管腔增大，組織間隙明顯增寬并充填有大量纖維組織，橫紋模糊斷裂。本課題前期臨床研究發(fā)現(xiàn)冠心病心氣虛患者普遍存在血漿兒茶酚胺類物質(zhì)的升高改變。而且有學(xué)者將60例CHD患者分為40例心氣虛證和20例非心氣虛證，檢測(cè)血漿（E、NE），結(jié)果顯示心氣虛證患者血漿中NE、E均升高，與非心氣虛證組及正常組比較差異顯著（P<0.01）［9］。CHD 心氣虛證患者血漿中兒茶酚胺明顯升高，說(shuō)明冠心病心氣虛心肌細(xì)胞的凋亡與兒茶酚胺類物質(zhì)的變化關(guān)系密切，而益氣活血方高劑量組能夠抑制并扭轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞的凋亡，而減輕心肌缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，說(shuō)明中藥益氣活血方可能是通過(guò)改變血漿兒茶酚胺類物質(zhì)的含量從而起到改善心功能的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Gs-AC-cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)的RyR2開(kāi)放異常，可以引起心肌收縮力的降低。開(kāi)放異常是由于當(dāng)兒茶酚胺類物質(zhì)含量升高時(shí)，使β-腎上腺素受體被持續(xù)激活，導(dǎo)致PKA過(guò)量產(chǎn)生，心肌細(xì)胞內(nèi)RyR2被過(guò)度磷酸化，導(dǎo)致RyR2通道功能性關(guān)閉不全，造成RyR2通道的舒張期鈣滲漏，繼而肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣庫(kù)內(nèi)的鈣離子量減少，影響收縮期細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)用于心肌興奮收縮耦聯(lián)所需的Ca2+減少，心肌收縮力降低，發(fā)生心功能減退。由此我們可以推測(cè)Gs-AC-cAMP-PKA信號(hào)通路介導(dǎo)的RyR2開(kāi)放異常很可能是引起心肌細(xì)胞凋亡的原因，具體作用機(jī)制有待于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步論證。

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