劉文，袁雪，王成雙，于子涵，曲永利，苗樹君，張愛忠，王志博，丁福君

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.鶴崗市東方紅鄉(xiāng)畜牧站）

pH和纖維水平對苜蓿纖維吸附銅的影響

劉文1，袁雪1，王成雙1，于子涵1，曲永利1，苗樹君1，張愛忠1，王志博1，丁福君2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.鶴崗市東方紅鄉(xiāng)畜牧站）

研究采用體外培養(yǎng)的方法，探究pH和纖維水平對苜蓿纖維吸附銅的影響。研究共分兩個試驗。試驗一：采用2×7析因試驗設(shè)計，設(shè)定兩個（3.0和5.5）pH水平及7個銅離子水平；試驗二：采用4×7析因試驗設(shè)計，設(shè)定0.125、0.25、0.5和1 g·mL-1的4個纖維水平及7個銅離子水平。體外39℃培養(yǎng)24 h。與pH 3.0相比，pH5.5時的銅離子被纖維吸附的比率更高（P＜0.05）；隨著纖維水平的增加，纖維吸附銅離子的比率和吸附量逐漸提高（P＜0.05）。因此得出結(jié)論：在pH3.0～5.5條件下，pH越低，苜蓿纖維對銅的吸附性越強；纖維水平越高，纖維對銅的吸附性越強。

苜蓿；吸附；銅；pH；纖維水平

銅是動物不可缺少的微量元素，作為體內(nèi)多種酶的成分，如細(xì)胞色素氧化酶在氧化磷酸化過程中起重要作用，銅也為血紅細(xì)胞正常形成所必需。此外，銅還是葡萄糖代謝、膽固醇代謝、骨骼礦化作用、免疫功能、紅細(xì)胞生成和心臟功能等機能代謝所必需的微量元素之一。NRC[1]報道在泌乳奶牛日糧中，硫酸鹽形式的無機微量元素銅的利用率僅為5%，奶牛容易發(fā)生銅攝入不足的情況。因此，研究影響奶牛對銅的利用效率的因素，有助于提高奶牛對銅的利用效率，以及在奶牛日糧中更加合理的添加銅具有重要指導(dǎo)意義[2，4]。Claye等[1，3]對5種纖維源（小麥麩、稻糠、燕麥纖維、蘋果渣和番茄纖維）及它們的不溶成分與銅結(jié)合的能力進(jìn)行了體外研究。研究發(fā)現(xiàn)，所有5種纖維中的半纖維素、木質(zhì)素和纖維素均可結(jié)

合銅元素。Sandstead[4]在關(guān)于銅的生物利用效率和需要的綜述中闡述：銅可與日糧中的半纖維素和木質(zhì)素形成不易溶解的復(fù)合物。Lee[5]研究表明，銅可被斑豆中的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維結(jié)合。Cummings[6]報道，當(dāng)人類食物中的纖維水平增加時，糞便中排泄出的微量元素的量升高。Drews[7]也發(fā)現(xiàn)，在青少年食物中添加的纖維素和半纖維素可顯著增加受試者糞便中的銅濃度，顯著降低受試者體內(nèi)的銅沉積。有研究表明[8]日糧纖維是造成哺乳犢牛和斷奶犢牛之間微量元素生物利用效率差異顯著的原因，斷奶犢牛對銅的生物利用效率明顯低于相同年齡的哺乳犢牛。Prevedello等[9]報道，飼喂?fàn)倥＠w維含量高的日糧時，小牛血液中鋅和銅的濃度降低，這表明小牛飼料中的纖維能夠影響銅的生物利用效率。有研究發(fā)現(xiàn)，綿羊日糧纖維濃度的線性增加會導(dǎo)致綿羊?qū)︿\、銅和錳的表觀吸收率線性降低[10]。Camire和Clydesdale[11]研究表明，纖維對金屬元素（鈣、鎂、鋅和鐵）的結(jié)合與pH有關(guān)。Thompson和Weber[12]報道，纖維中的內(nèi)源性的礦物質(zhì)（銅、鋅和鐵）在低pH時，與纖維不結(jié)合，而當(dāng)pH上升時，這些礦物質(zhì)又重新與纖維結(jié)合。苜蓿被稱為牧草之王，其含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是奶牛的高標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)質(zhì)飼草，可替代部分精飼料，并能提高乳脂率，增加產(chǎn)奶量。苜蓿中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量豐富，中性洗滌纖維和酸洗洗滌纖維含量高，從理論上來說具有結(jié)合微量元素銅的能力。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于銅被苜蓿結(jié)合情況的研究還未見報告。

雖然目前有機微量元素已經(jīng)在反芻動物日糧中使用，但是無機微量元素仍是最為常用的日糧中添加的微量元素源。試驗通過設(shè)定不同的pH和纖維水平，研究無機微量元素被纖維結(jié)合的比率及數(shù)量，從而探究pH和纖維水平對無機微量元素被纖維結(jié)合的規(guī)律，為提高奶牛對銅的利用效率，以及在奶牛日糧中更加合理的添加銅具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2013年3～5月，在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院反芻動物營養(yǎng)研究室進(jìn)行。

1.2 苜蓿纖維的制備

將使用的苜蓿粉碎后，過1 mm的篩，取X g粉碎的苜蓿置于一個大小適宜的錐形瓶，并注入Y mL蒸餾水，39℃振蕩培養(yǎng)2 h，其中X/Y=5/100，以除去水溶性成分。然后將其水洗，直至水變澄清為止，將過濾殘余物在65℃烘干24 h。

1.3 不同pH條件下苜蓿纖維對銅的吸附

試驗設(shè)置3個重復(fù)，在50 mL的離心管中加入預(yù)先制備好的苜蓿0.5 g，編號并記錄樣品重量，分別加入30 mL pH3.0和pH5.5的7個濃度的硫酸銅溶液，搖勻，放置于搖床上，39℃培養(yǎng)24 h，取出，在22℃下1 000 r·min-1離心15 min移取上清液，通過直徑為25 mm、孔徑45 μm的濾膜過濾，所得液體用于測定銅含量。按照上面步驟準(zhǔn)備對照管（不添加纖維）以計算纖維吸附銅的吸附率及量。

1.4 不同纖維水平條件下苜蓿纖維對銅的吸附

試驗設(shè)置3個重復(fù)，在50 mL的離心管中加入0.125、0.25、0.5和1 g的苜蓿，再分別加入pH 5.5的7個濃度的硫酸銅溶液，搖勻，放置于搖床上，39℃培養(yǎng)24 h，取出，在22℃下1 000 r·min-1離心15 min移取上清液，通過直徑為25 mm、孔徑45 μm的濾膜過濾，所得液體用于測定銅含量。按照上面步驟準(zhǔn)備對照管（不添加纖維）以計算纖維吸附銅的吸附率及量。

1.5 銅的測定和苜蓿纖維吸附銅比率及數(shù)量的計算

以TAS-990原子吸收分光光度計測定銅含量。配置標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0、2、4、6、8和10 mg·L-1，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，在324.7 nm波長下檢測銅含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出試驗樣品的銅濃度。苜蓿纖維吸附銅比率的計算公式如下：

吸附比率=（對照管的銅濃度-培養(yǎng)后的含纖維的培養(yǎng)管中的銅濃度）/對照管的銅濃度。

吸附量=（對照管的銅濃度-培養(yǎng)后的含纖維的培養(yǎng)管中的銅濃度）×溶液體積

1.6 試驗設(shè)計

試驗共分兩部分，試驗一采用2×7析因試驗設(shè)計，設(shè)定3.0和5.5兩個pH水平及15.625、31.25、62.5、125、250、500和1 000 mg·L-17個銅水平；試驗二采用4×7析因試驗設(shè)計，設(shè)定0.125、0.25、0.5、1 g·30 mL-1的4個纖維水平及15.625、31.25、62.5、125、250、500和1 000 mg·L-17個銅水平。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel記錄并做簡單處理，然后采用

SAS 9.12（2003）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行一般線性模型（GLM）程序進(jìn)行兩因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，并進(jìn)行Duncan多重比較。同時分析pH和纖維水平影響纖維吸附銅比率及量的直線及二次曲線反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 pH水平對纖維吸附銅的影響

2.1.1 pH水平對纖維吸附銅比率的影響

圖1和表1列出了pH水平對纖維吸附銅比率的結(jié)果。從表1可以看出，總體上來說pH3.0條件下的纖維吸附銅比率（平均值67.43%）比pH5.5條件下的纖維吸附銅比率（平均值71.00%）低3.57%（P＜0.01）。從圖1可以看出，隨著銅濃度水平的增加，不同pH條件下的纖維吸附銅的比率總體上都呈下降趨勢（P＜0.01）。從表1也可看出，隨著銅濃度水平的提高，纖維吸附銅的比率表現(xiàn)出顯著的二次曲線下降趨勢（Q，P＜0.001）。

圖1 pH水平對纖維吸附銅比率的影響Fig.1Effects of pH on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

表1 pH水平對纖維吸附銅比率的影響Table 1Effects of pH on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

2.1.2 pH水平對纖維吸附銅量的影響

圖2 pH水平對纖維吸附銅量的影響Fig.2Effects of pH on absorption amount of copper fiber

圖2和表2列出了pH水平對纖維吸附銅量的結(jié)果。從圖2和表2可以看出，總體上來說pH3.0條件下的纖維吸附銅的量（平均值3.13 g）比pH5.5條件下的纖維吸附銅的量（平均值3.72 g）低0.59 g（P＜0.01）。從圖2也可以看出，隨著銅濃度水平的增加，不同pH條件下的纖維吸附銅的量總體呈先上升然后下降趨勢（P＜0.01）。表2也表明，隨銅濃度水平的提高，纖維吸附銅的量表現(xiàn)出顯著的二次曲線趨勢（Q，P＜0.001）；在500 mg·L-1銅濃度水平時，纖維吸附銅的比率下降。

表2 pH水平對纖維吸附銅量的影響（g）Table 2Effects of pH on adsorption amount of copper fiber（g）

2.2 纖維水平對纖維吸附銅的影響

2.2.1 纖維水平對纖維吸附銅比率的影響

圖3和表3列出了纖維水平對纖維吸附銅比率的結(jié)果。從圖3表3可以看出，隨著纖維水平的提高，纖維吸附銅的比率逐漸上升（P＜0.01），隨著銅濃度水平的增加，纖維吸附銅的比率總體呈下降趨勢（P＜0.01）。從表3也可以看出，隨著銅濃度的增加，除1.00 g纖維水平的纖維吸附銅的比率呈線性變化規(guī)律外（L，P＜0.001），其它三個纖維水平的纖維吸附銅的比率總體上表現(xiàn)出明顯的二次曲線上升趨勢（Q，P＜0.001）。

圖3 纖維水平對纖維吸附銅比率的影響Fig.3Effects of fiber level on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

表3 纖維水平對纖維吸附銅比率的影響Table 3Effects of fiber level on absorption rate of Cu to alfalfa fiber

2.2.2 纖維水平對纖維吸附銅量的影響

纖維水平對纖維吸附銅量的結(jié)果見圖4和表4。從圖4和表4可以看出，隨著纖維水平的提高，纖維吸附銅的量逐漸上升（P＜0.01），隨著銅濃度水平的增加，纖維吸附銅的量總體呈上升趨勢（P＜0.01）。從表4也可以看出，隨著銅濃度的增加，除0.125 g纖維水平的纖維吸附銅的量呈線性變化規(guī)律外（L，P＜0.001），其它三個纖維水平的纖維吸附銅的量表現(xiàn)出明顯的二次曲線上升趨勢（Q，P＜0.001）。

圖4 纖維水平對纖維吸附銅量的影響Fig.4EffectsoffiberlevelonabsorptionamountofCutoalfalfafiber

表4 纖維水平對纖維吸附銅量的影響Table 4Effects of fiber level on absorption amount of Cu to alfalfa fiber

3 討論

纖維能夠通過物理和化學(xué)兩種方式吸附微量元素。物理吸附主要依靠纖維的物理性狀，如疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、較大的比表面積和較大的黏性等，通過范德華力等達(dá)到吸附效果；而化學(xué)吸附主要依靠纖維化學(xué)結(jié)構(gòu)中的活性基團，如羧基、羥基等，通過配位絡(luò)合及離子交換等作用達(dá)到吸附效果。纖維對微量元素離子的吸附與pH有關(guān)，pH對物理吸附的影響不大，主要影響化學(xué)吸附。pH會影響纖維中活性基團如羧基、羥基等的解離度[13-14]。隨著pH的升高，活性基團上的質(zhì)子解離增多，對微量元素離子的吸附量隨之增大，反之pH降低則吸附減少。本研究發(fā)現(xiàn)，在pH5.5條件下的銅離子被纖維吸附的比率均比pH3.0條件下的銅離子被纖維吸附的比率高；而在pH3.0條件下的未被吸附（游離）的銅離子量比pH5.5條件下未被吸附（游離）的銅離子的量高。反芻動物瘤胃的pH比其皺胃pH高，因此日糧纖維在瘤胃環(huán)境中對微量元素離子的吸附作用要高于皺胃環(huán)境。因此可以初步得出在反芻動物瘤胃環(huán)境中，纖維對微量元素的吸附比皺胃中要高，在瘤胃中的可利用（游離）的銅離子更少。從表1中125 mg·L-1銅濃度前后吸附率的變化可以看出，前4個銅濃度的吸附率變化不大，而后3個銅濃度的吸附率變化很大，可以看出纖維對銅的吸附存在閾值效應(yīng)，當(dāng)銅濃度過大，超過纖維吸附的閾值時，纖維吸附銅的比率會大幅度下降。從表2中銅的吸附量可以看出，500 mg·L-1的銅濃度時的吸附量最大，表明纖維對銅的吸附量有一個飽和度。當(dāng)纖維吸附銅的量達(dá)到飽和度時，繼續(xù)加大銅濃度水平能使銅的吸附量減小，進(jìn)而增加可被動物吸收利用的游離銅量，但是過高的銅濃度會對瘤胃微生物和反芻動物有毒害作用。

Kabaija和Smith[10]研究表明，綿羊日糧纖維水平的線性增加會導(dǎo)致綿羊?qū)︿\、銅和錳的表觀吸收率線性降低。Cummings[6]報道，攝入的纖維越多糞中礦物質(zhì)排出的越。研究發(fā)現(xiàn)，隨著纖維水平的增加，纖維吸附銅離子的比率和吸附量逐漸提高，游離銅量逐漸降低。因此，可以看出日糧纖維對微量元素的吸附作用（減少了可利用的微量元素）很可能是反芻動物微量元素生物利用效率低的原因之一，但這一結(jié)論仍需進(jìn)一步的體內(nèi)驗證。從125 mg·L-1的銅濃度水平開始，隨著銅濃度水平的提高，不同纖維水平的纖維吸附銅的比率逐漸下降，游離的銅量逐漸增加，可以看出當(dāng)超過這一銅濃度時，可利用的銅（游離銅）才會明顯增加。如果我們要增加反芻動物對銅離子的吸收，可能要在125 mg·L-1銅離子濃度以上，而125 mg·L-1銅離子濃度以下效果不明顯。

4 結(jié)論

體外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液pH3.0時的苜蓿纖維對銅的吸附率比培養(yǎng)液pH5.5時的苜蓿纖維對銅的吸附率高，表明pH越低，苜蓿纖維對銅的吸附性越強；體外培養(yǎng)條件下，纖維對銅的吸附率隨著纖維水平的增加（0.125、0.25、0.50、1.00）而提高，表明纖維水平越高，苜蓿纖維對銅的吸附性越強。

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Effects of pH and Fiber Level on Absorption of Copper to Alfafa Fiber in Vitro

Liu Wen1，Yuan Xue1，Wang Chengshuang1，Yu Zihan1，Qu Yongli1，Miao Shujun1，Zhang Aizhong1，Wang Zhibo1，Ding Fujun2
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319; 2.Dongfanghong Township Livestock Station of Hegang）

The objective of the study was to investigate the effects of pH and fiber level on absorption of copper to alfafa fiber in vitro.In experiment 1，the absorption of copper to alfalfa fiber under pH（3.0 or 5.5）was determined with 7 copper concentrations in 2×7 factorial design.In experiment 2，the absorption of copper to alfalfa fiber under 4 fiber level（0.125，0.25，0.5，1 g·mL-1）was determined with 7 copper concentrations in 4×7 factorial design.Comparing with absorption rate of copper to alfalfa fiber under pH 3.0，the absorption rate of copper to alfalfa fiber was higher under pH 5.5（P＜0.05）.With the increased fiber level，the absorption rate or amount of copper to alfalfa fiber increased gradually（P＜0.05）.Under the condition of pH 3.0-5.5，the pH was lower，and the absorption ability of copper to alfalfa fiber was the higher.The level fiber was higher，and the absorption ability of copper was higher.

alfalfa；absorption；copper；fiber level；pH

X53

A

1002-2090（2015）02-0032-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2015.02.008

2014-03-24

國家科技部支撐項目（東北農(nóng)區(qū)奶牛規(guī)?；】叼B(yǎng)殖生產(chǎn)技術(shù)集成和產(chǎn)業(yè)化示范：2012BAD12B05-01）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動計劃（XYB2013-13）；墾區(qū)奶牛高效精養(yǎng)與營養(yǎng)調(diào)控關(guān)鍵技術(shù)研究（KNKXIV-08-01-01）。

劉文（1990-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院2013級碩士研究生。

王志博，男，講師，E-mail：andywangdge@163.com。