宋志琦，楊利峰，王運(yùn)盛，朱 婷，趙德明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193）

BAT3過表達(dá)提高內(nèi)源朊蛋白的表達(dá)量

宋志琦，楊利峰，王運(yùn)盛，朱 婷，趙德明

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國家動(dòng)物海綿狀腦病實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193）

為了檢測BAT3蛋白與朊蛋白的相互作用，探討B(tài)AT3蛋白在朊蛋白合成和降解以及海綿狀腦病發(fā)生過程中所起的作用。構(gòu)建能夠在細(xì)胞中表達(dá)全長朊蛋白的真核表達(dá)載體pGEFP-N1-PRNP和表達(dá)全長BAT3蛋白的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HA-BAT3，應(yīng)用脂質(zhì)體方法分別將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hela細(xì)胞，原代神經(jīng)元，Neuro2a細(xì)胞。利用免疫熒光技術(shù)觀察內(nèi)源BAT3與全長朊蛋白的相互作用情況，利用免疫印跡技術(shù)檢測BAT3過表達(dá)對內(nèi)源朊蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果在Hela細(xì)胞和原代神經(jīng)元內(nèi)，轉(zhuǎn)染pGEFP-N1-PRNP后，自發(fā)綠色熒光蛋白的全長朊蛋白與內(nèi)源BAT3發(fā)生共定位；Hela細(xì)胞和Neuro2a細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA-BAT3后，隨著外源全長BAT3表達(dá)量的增加，內(nèi)源朊蛋白的表達(dá)量表現(xiàn)為劑量依賴性增加。表明BAT3能與朊蛋白發(fā)生相互作用，過表達(dá)BAT3能促進(jìn)內(nèi)源朊蛋白的表達(dá)，提示BAT3可能影響朊蛋白的合成。

BAT3；朊蛋白；原代神經(jīng)元；蛋白合成；傳染性海綿狀腦病

朊病毒?。≒rion disease）是一組累積人類和動(dòng)物的傳染性神經(jīng)退行性疾病，隨著瘋牛病和人類變異性克雅氏?。╲ariant Creutzfeldt-Jacob dis?ease，vCJD）的出現(xiàn)，該類疾病對公共衛(wèi)生和人類健康的威脅日益顯著。組織病理學(xué)病變局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS），以神經(jīng)元空泡化、灰質(zhì)海綿狀病變、神經(jīng)元喪失、神經(jīng)膠質(zhì)和星狀細(xì)胞增生、病原因子PrPsc蓄積和淀粉樣蛋白斑塊為特征。朊蛋白（PrPC）是機(jī)體中正常的糖基化蛋白，能夠被蛋白酶所降解，但是當(dāng)它改變了構(gòu)象變成了異常朊蛋白（PrPSc）后就不能被蛋白酶所降解，逐步聚集，從而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性，最終導(dǎo)致死亡[1-2]。BAG-6（又稱Scythe；HLA-B基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3，BAT-3），最初是在蟾卵提取物中純化得

到的，分子量為150 kDa。BAT3是一個(gè)多功能蛋白，其中一項(xiàng)重要的功能是其對細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的合成及降解的影響[3-4]。但是BAT3在神經(jīng)細(xì)胞中的過表達(dá)對由朊蛋白的影響尚未見相關(guān)報(bào)道。研究BAT3與朊蛋白的相互作用，對朊病及由錯(cuò)誤折疊蛋白引起疾病的治療可能有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 BAT3鼠源單克隆抗體，細(xì)胞色素c兔源多克隆抗體，購自Santa Cruz公司；HA標(biāo)簽鼠源單克隆抗體，β-actin兔源多克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，購自Bio?world公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗,Alexa Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的山羊抗兔二抗，兔源TUBB3/betaIII tubulin（神經(jīng)元標(biāo)記物），購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，神經(jīng)元III族-β-Tubu?lin（Tuj1）抗體，DAPI二氫氯化物和碘化丙啶（PI），免疫熒光染色用的免疫固定液、免疫洗滌液，免疫封閉液，購自碧云天生物技術(shù)公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和無血清培養(yǎng)基Opti-MEM，購自Invitrogen公司；電泳儀：BIORAD美國；電轉(zhuǎn)儀：BIO-RAD美國。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Hela細(xì)胞和N2a細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 取出液氮罐中裝有N2a細(xì)胞的凍存管，立即放入預(yù)熱至37℃的水浴中并搖動(dòng)，使管中細(xì)胞懸液快速融化，然后低速800 r/min離心5min，離心后棄去凍存液，取1 m L完全DMEM培養(yǎng)基加至管中反復(fù)吹打，吸出吹打后的液體加至培養(yǎng)瓶中，重復(fù)沖洗吹打1次。用含20%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基4～5mL，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。

1.2.2 原代神經(jīng)元的分離與培養(yǎng) 出生24 h內(nèi)的SD乳鼠75%酒精浸泡消毒5～10min，在解剖顯微鏡下分離出雙側(cè)大腦皮層，仔細(xì)剝除軟腦膜和血管，然后沉淀洗滌分離出的組織5～6次（每次靜止2min，棄上清），將分離的大腦皮質(zhì)部分剪碎成1～2 mm3的小組織塊。將組織懸液置于無菌的瓶中消化，加入終濃度3mg/mL木瓜蛋白酶+適量（0.05 mg/mL）DNA酶。37℃培養(yǎng)箱消化30～40min，每10 min稍微搖動(dòng)一下。加入少許血清終止反應(yīng)，1 000 r/min，離心5 min棄上清，加入DMEM。用大口徑吸管（配合槍頭吹打）輕輕吹打組織塊使細(xì)胞均勻分散為初細(xì)胞懸液。胎盤藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后1 000 r/min離心5min，用10%胎牛血清的DMEM/F12+0.5%B27培養(yǎng)液懸起細(xì)胞沉淀。將初細(xì)胞懸液經(jīng)計(jì)數(shù)稀釋到2× 106個(gè)/mL。

1.2.3 構(gòu)建質(zhì)粒 帶綠色熒光蛋白全長PRP質(zhì)粒pGEFP-N1-PRNP的構(gòu)建：根據(jù)GenBank中AYp 456，Homo sapiens prion protein（PRNP）mRNA，設(shè)計(jì)擴(kuò)增PrP全長基因序列的PCR引物（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）。以Hela細(xì)胞的cDNA作為模板，上游引物：ATA CTCGAGATGGCG AACCTTGGC TGC T；下游引物ACTAAGCTTTCC CAC TATCAG GAA GATGAG，兩端分別插入Hind III、Xho I酶切位點(diǎn)。經(jīng)用Hind III、Xho I雙酶切的目的基因與同樣雙酶切的pGEFP-N1進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切和測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功。pcDNA3.1-HA-BAT3重組質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)唐軍教授贈(zèng)送。

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 收獲處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞、N2a細(xì)胞或原代神經(jīng)元細(xì)胞，以2×105/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長至80%～90%融合，按轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用于Western Blot檢測的細(xì)胞分為陰性對照組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA空載體）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HA-BAT3重組質(zhì)粒）。用于免疫熒光試驗(yàn)的細(xì)胞接種于之前鋪好爬片的12孔培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染48 h后收集蛋白進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

1.2.5 免疫熒光試驗(yàn) 用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到12孔板內(nèi)，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。種入細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長良好后，進(jìn)行過表達(dá)或用毒性多肽處理。前期試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行免疫熒光染色。用免疫染色固定液室溫固定30min以上。固定完畢后，用免疫染色洗滌液洗滌兩次，每次5min。加入免疫染色封閉液，封閉60 min。按照適當(dāng)比例用稀釋一抗。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，37℃孵育2 h。之后棄去一抗，洗滌液洗滌5min，共洗滌3次。按照適當(dāng)比例稀釋二抗：Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋比例都為1∶100。 吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，37℃孵育1 h。之后加入免疫染色洗滌液，洗滌5min，共洗滌3次。最后加入DAPI

染核3min，洗滌5min，共洗滌3次。用抗淬滅劑封片，在正置激光共聚焦顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）下觀察試驗(yàn)結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 原代神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定 首先，用兩種神經(jīng)元特異性抗體TUBB3/beta III tubulin神經(jīng)元標(biāo)記物和Tuj1對分離的神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，如中插彩版圖1所示，兩種抗體的熒光染色都顯示分離的神經(jīng)元純度很高，達(dá)到90%以上可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 內(nèi)源BAT3與全長朊蛋白發(fā)生共定位 將構(gòu)建好的帶綠色熒光標(biāo)簽的全長PrP載體，分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hela細(xì)胞（見中插彩版圖2 A）和原代神經(jīng)元細(xì)胞（見中插彩版圖2 B）。用免疫熒光染色方法觀察到內(nèi)源BAT3與外源全長朊蛋白發(fā)生共定位，在Hela細(xì)胞中，外源朊蛋白主要以顆粒及聚集形式分布于胞漿，并且與BAT3在胞漿中發(fā)生共定位，在原代神經(jīng)元中，外源朊蛋白散在分布于胞漿，在核周圍的胞漿與BAT3發(fā)生共定位。

2.3 過表達(dá)BAT3后，內(nèi)源性朊蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性增加 將不同劑量的BAT3轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hela細(xì)胞（圖3 A）和Neuro2a細(xì)胞（圖3 B），通過免疫印跡檢測蛋白的表達(dá)情況。經(jīng)過對免疫印跡條帶的密度分析，我們發(fā)現(xiàn)，隨著BAT3轉(zhuǎn)染劑量的增加，內(nèi)源朊蛋白的表達(dá)量也逐漸升高，并且它們之間的關(guān)系呈正相關(guān)。

圖3 外源BAT3的表達(dá)與內(nèi)源朊蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性A：BAT3在Hela細(xì)胞中過表達(dá)，并分別檢測朊蛋白（PrP）、BAT3、內(nèi)參蛋白β-actin的變化情況，密度分析量化免疫印跡結(jié)果；B：對N2A細(xì)胞的分析結(jié)果。*：P＜0.05，**：P＜0.01

3 討論

不能正確靶向的膜蛋白要被釋放到細(xì)胞漿中。這種錯(cuò)誤定位的蛋白需要被及時(shí)清除以保持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，否則可能會發(fā)生蛋白聚集物的積聚現(xiàn)象。BAT3作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解過程中核心的分子伴侶，它與錯(cuò)誤折疊和定位的朊蛋白之間關(guān)系尚未研究清楚。異常朊蛋白可以在去污劑作用下發(fā)生沉淀反應(yīng)和在細(xì)胞外聚集形成淀粉樣斑塊，這說明異常朊蛋白具有很強(qiáng)的聚集、聚合的特性[7-8]。了解BAT3與朊蛋白之間的關(guān)系，有利于分析異常朊蛋白的合成與降解，為異常朊蛋白的細(xì)胞內(nèi)清除，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)提供相關(guān)依據(jù)，也將為朊蛋白病的早期診斷和藥物治療開辟新的思路。

[1]Brown P，Gibbs C J，Rodgers-Johnson P，et al.Human spongi?form encephalopathy：the National Institutes of Health series of 300 cases of experimentally transmitted disease[J].Ann Neurol，1994，35（5）：513-529.

[2]Prusiner S B.Novel proteinaceous infectious particles cause scra?pie[J].Science，1982，216（4542）：136-144.

[3]Hegde R S，Keenan R J.Tail-anchored membrane protein inser?tion into the endoplasmic reticulum[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12（12）：787-798.

[4]MinamiR，Hayakawa A，Kagawa H，et al.BAG-6 is essential for selective elimination of defective proteasomal substrates[J].JCell Biol，2010，190（4）：637-650.

[5]Chakrabarti O，Rane N S，Hegde R S.Cytosolic aggregates per?turb the degradation of nontranslocated secretory and membrane proteins[J].Mol Biol Cell，2011，22（10）：1625-1637.

[6]Emerman A B，Zhang ZR，ChakrabartiO，etal.Compartment-re?stricted biotinylation reveals novel features of prion protein metab?olism in Vivo[J].Mol Biol Cell，2010，21（24）：4325-4337.

Overexpression of BAT3 enhanced cellular levels of endogenous prion protein

SONG Zhi-qi，YANG Li-feng，WANG Yun-sheng，ZHU Ting，ZHAODe-ming
（State Key Laboratories for Agrobiotechnology，Key Lab of Animal Epidemiology and Zoonosis，Ministry of Agriculture，National Animal Transmissible Spongiform Encephalopathy Laboratory，College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

To investigate the relationship between BAT3 and prion protein in vitro and exp lore the possible function of BAT3 in the expression of prion protein and associated diseases.The overexpression p lasm id PGEFP-N1-PRNP was constructed and transfected into Hela cells and primary cortical neurons.The immunofluorescencemicroscopy was chosen to analyze the relation?ship between BAT3 and prion protein.pcDNA3.1-HA-BAT3 was constructed and transfected into Hela cells and Neuro2a cells in different amounts.Western blotting was used to examine the expression levels of prion protein after the transfection with different doses of BAT3.BAT3 and prion protein co-localized in the cytoplasm of Hela cells and primary neuronal cells.With the increasing expression of exogenous BAT3，the endogenous prion protein levels were enhanced in Hela cells and Neuro2a cells.Conclusion BAT3 interacted with prion protein in cytoplasm and markedly increased the endogenous expression of prion protein in Hela and Neuro2a cells.It is possible that BAT3m ightstabilize prion protein and influence its subsequent cellular function（s）.

BAT3；prion protein；primary cortical neurons；protein synthesis

ZHAODe-ming

R 5893

A

0529-6005（2015）11-0009-03

2014-08-22

國家自然科學(xué)基金（31272532）

宋志琦（1989-），女，博士生，主要從事動(dòng)物海綿狀腦病致病機(jī)制方面研究和獸醫(yī)病理學(xué)方面工作，E-mail：song?zhiqi1989@gmail.com

趙德明，E-mail：zhaodm@cau.edu.cn