李艷，寧秋，韓德明，姚海虹，趙赫楠，趙麗輝

（1.長春理工大學(xué) 校醫(yī)院，長春 130022；2.遼源職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥分院，遼源 136200；3.長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022）

流感病毒與宿主的相互作用通常會產(chǎn)生宿主種間屏障作用抵御流感病毒的感染，導(dǎo)致流感病毒不能感染宿主。流感病毒感染宿主后，宿主表現(xiàn)出以呼吸器官損傷為主的病理過程，引起發(fā)病或死亡。病毒也可以在宿主體內(nèi)復(fù)制但不發(fā)病，使宿主產(chǎn)生天然性免疫或適應(yīng)性免疫，從而有效地抵御病毒的侵襲，因此宿主即使被病毒感染也不會表現(xiàn)其致病性，宿主體內(nèi)的各種細胞因子影響了流感病毒的致病性［1，2］。

干擾素（interferon，IFN）是一種糖蛋白，是一種由淋巴細胞和單核細胞產(chǎn)生的細胞因子。人們目前已發(fā)現(xiàn)有α、β、γ三種類型的干擾素，I型的干擾素包括α型（IFN-α）和β型干擾素（IFN-β），IFN-α是由白細胞產(chǎn)生的，IFN-β是由成纖維細胞產(chǎn)生的，而γ型干擾素（IFN-γ）是由免疫系統(tǒng)中的自然殺傷細胞（NK細胞）和T細胞產(chǎn)生的［3］。IFN-α通過調(diào)控免疫應(yīng)答來抑制病毒蛋白的合成，IFN-α和細胞膜上干擾素受體結(jié)合后，經(jīng)過一系列的激活過程會誘導(dǎo)干擾素激活基因的轉(zhuǎn)錄，抑制病毒蛋白的合成，也可以通過激活促凋亡蛋白和細胞周期抑制蛋白產(chǎn)生抗病毒作用［4，5］。由干I型IFN-α/β參與的抗病毒感染天然免疫應(yīng)答是機體在長期進化過程中形成的抵抗病毒入侵的主要防御機制之一，它在機體抗病毒侵染及誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面起著非常重要的作用［6］。處在流感病毒感染時期患者，最初在病毒感染的幾小時之內(nèi)即被誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α/β，識別的過程是RNA病毒和胞內(nèi)RIG-1受體和Toll樣受體（TLRs）識別、結(jié)合，啟動了干擾素應(yīng)答反應(yīng)。RNA病毒侵染的是呼吸道上皮細胞，通過識別維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-1）胞內(nèi)受體，激活天然免疫系統(tǒng)和哺乳細胞內(nèi)抗病毒的干擾素通路，誘導(dǎo)I型干擾素的表達，最終清除感染部位的病毒［7，8］。這些研究進一步表明IFN-α/β在抗流感病毒感染、誘導(dǎo)天然免疫及適應(yīng)性免疫過程中起著至關(guān)重要的作用［9-11］。

綜上所述，為了進一步研究干擾素在機體抗流感病毒的作用，實驗利用普通流感病毒鼻滴感染小鼠，通過測定小鼠外周血中IFN-α含量的變化，來研究普通流感病毒感染小鼠過程中IFN-α的變化規(guī)律及IFN-α抗病毒的作用機制，為進一步研制新型通用流感疫苗奠定實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料、儀器

取感染普通流感病毒的患者的血液（患者血液來自長春理工大學(xué)校醫(yī)院），于冰箱4℃保存。6-8周齡Balb/c小鼠（購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心）。乙醚；1640培養(yǎng)基；無血清的DMEM液；IFN-α試劑盒；PBS緩沖液；酒精，聚肌胞Poly（I：C）（主要試劑購買鼎國生物技術(shù)有限公司）。超凈工作臺（FromaScientific）；離心機；酶標(biāo)儀；冰箱；濾菌器；高壓鍋；離心管；三孔電熱恒溫水槽（儀器購買上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物感染實驗

將小鼠隨機分為五組，其中設(shè)置兩組對照組，分別為空白對照組和陽性對照組，剩下的三組分別為普通流感病毒的三個濃度實驗組，記為C1組，C2組，C3組。每組小鼠8只，一共40只。小鼠在相同飼養(yǎng)條件下進行飼養(yǎng)。

各組小鼠用乙醚輕度麻醉后，空白對照組滴鼻無血清的DMEM液，陽性對照組滴鼻Poly（I：C）試劑，其余各組分別滴鼻含普通流感病毒的血液，設(shè)不同的濃度梯度。

1.2.2 小鼠血清收集與測定

小鼠感染 1d，2d，4d，6d后，斷尾取血，離心3000r/min，15min，收集血清，血清置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

具體步驟：

（1）設(shè)置陰性、陽性、標(biāo)準(zhǔn)品和實驗孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品5μL；

（2）陰性、陽性和實驗孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

（3）陰性、陽性孔和實驗孔分別加入辣根過氧化物酶（HRP標(biāo)記的檢測抗原）100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min；

（4）棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；

（5）每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；

（6）每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

2 結(jié)果分析

普通流感病毒通過滴鼻感染小鼠，經(jīng)過一周的觀察，感染病毒的小鼠前三天精神萎靡，活動量少，之后活動量逐漸增加，進食量也有所增加，精神狀態(tài)良好，恢復(fù)正常小鼠表現(xiàn)狀態(tài)。小鼠滴鼻普通流感病毒1d，2d，4d，6d摘除眼球靜脈取血，離心取上清液，ELISA雙抗體夾心檢測法檢測血液IFN-α。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)干擾素ELISA試劑盒的要求，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 干擾素ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD值

由標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可知，樣品的OD值與樣品濃度成正比。圖中標(biāo)注了趨勢線的方程以及方差值R2=0.9824，P＜0.01，數(shù)據(jù)可信，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程可以推算出檢測樣品中IFN-α的含量。

2.2 感染病毒的小鼠血清中IFN-α含量的檢測

圖2 小鼠體內(nèi)IFN-α的變化（▲為陽性，■實驗組，◆陰性）

實驗組小鼠分別滴鼻流感病毒為12.5mg/mL、25mg/mL、37.5mg/mL，1d，2d，4d，6d檢測小鼠血清中IFN-α的含量。由圖可以看出，陰性對照組中，小鼠體內(nèi)的干擾素含量保持平衡，而實驗組和陽性對照組出現(xiàn)隨著感染時間的增加而出現(xiàn)一定的變化規(guī)律。在感染的2d，小鼠血清中的IFN-α含量達到最大值，4d時觀察，血清中的IFN-α含量下降，到6d時，血清中的IFN-α含量逐漸回落到一定的水平。

陰性組滴鼻小鼠不同濃度的無血清培養(yǎng)液后，小鼠血液中的IFN-α的含量無明顯的變化，說明DMEM無血清培養(yǎng)液進入小鼠體內(nèi)后不會引起機體防御系統(tǒng)的應(yīng)答，而陽性藥物Poly（I：C）滴鼻進入小鼠體內(nèi)后激活了機體防御系統(tǒng)產(chǎn)生了干擾素。Poly（I：C）導(dǎo)致小鼠血清中IFN-α含量變化隨著時間的增加而增加，到2小時達到高峰，然后逐漸回落，第4天血液中的IFN-α含量逐漸降低，第6天血清中IFN-α的含量保持平衡水平。

3 討論

流感病毒感染小鼠后的臨床癥狀在很大程度上取決于病毒復(fù)制與宿主防御反應(yīng)的平衡關(guān)系。流感病毒逃避宿主免疫應(yīng)答的能力對其致病力是至關(guān)重要的［12］。宿主細胞通過模式識別受體（PRRs）識別病毒的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），迅速啟動了由干擾素和相關(guān)的細胞因子介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，阻止了病毒的侵染［13］。通過分泌I型IFN-α并和受體結(jié)合，利用激活的JAK/STAT途徑活化干擾素刺激因子產(chǎn)生抗病毒作用。目前，人們在對流感病毒的致病性進行研究的同時，也在研究宿主自身的抗病毒的作用，尤其對流行的高致病性流感病毒感染小鼠和非人類靈長類動物的研究，同時更多關(guān)注的是自身細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的多種細胞因子的抗病毒作用。由于細胞因子能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的進程和發(fā)展趨勢，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中、促進免疫細胞活化和清除病毒方面的作用非常重要。所以，為了研究I型IFN-α在抗病毒中的作用，實驗選擇感染流感病毒第三天的患者的血液，取血清給小鼠進行滴鼻實驗。在低于12.5μL血清滴鼻實驗時，干擾素IFN-α的變化的規(guī)律不明顯，高于14μL小鼠死亡過半，為此選擇12.5mg/mL、25mg/mL、37.5mg/mL三個濃度梯度進行試驗。對滴鼻實驗小鼠進行觀察，分別在1d，2d，4d，6d斷尾取血，通過ELISA實驗發(fā)現(xiàn)第二天血清中的IFN-α含量達到最大值，然后開始下降，最后趨于平穩(wěn)的表達水平，如圖2所示。研究還發(fā)現(xiàn)不同量的普通流感病毒的感染小鼠機體后，檢測小鼠機體感染不同時間后血液中IFN-α含量，同一劑量的普通流感病毒感染小鼠，小鼠血液中IFN-α含量隨著時間的變化而變化，顯現(xiàn)出隨著時間增加IFN-α含量先增加再降低，然后維持在一定水平。實驗結(jié)果表明普通流感病毒的感染會引發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，促使免疫細胞產(chǎn)生的干擾素通過細胞表面受體產(chǎn)生抗病毒的蛋白抑制了病毒的復(fù)制，增強了巨噬細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）的活力。實驗結(jié)果為進一步研制新型通用流感疫苗奠定實驗理論基礎(chǔ)。

［1］Subhendu Kumar Otta.Host and virus protein interaction studies in understanding shrimp virus gene function［J］.Indian J.Virol，2012，23（2）：184-190.

［2］Shinichi Yokota，Tamaki Okabayashi，Nobuhiro Fujii.The battle between virus and host：modulation of toll-Like receptor signaling pathways by virus infection［J］.Mediators of Inflammation，2010：1-12.

［3］盧年芳，黃愛龍.干擾素抗病毒作用的機制［J］.國外醫(yī)學(xué)：流行病學(xué).傳染病學(xué)分冊，2003（4）：226-228.

［4］Tetsuo Tsuchida1，Taro Kawai1，Shizuo Akira1.Inhibition of IRF3-dependent antiviral responses by cellular and viral proteins［J］.Cell Research，2009（19）：3-4.

［5］李小瑋，陳澤婷，智緒亭.IFN-α誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路的研究進展［J］.前沿與進展，2012，15（7）：548-551.

［6］王怡，周國平.干擾素調(diào)節(jié)因子3的激活［J］.生命的化學(xué)，2010，30（4）：523-527.

［7］Finlay McNab，Katrin Mayer Barber，Alan Sher，al et.Type I interferons in infectious disease［J］.Nature Reviews Immunology，2015（15）：87-103.

［8］Takeuchi O，Akira S.Innate immunity to virus infection［J］.Immunological Reviews，2009（227）：75-86.

［9］Takeuchi O，Akira S.MDA5/RIG-I and virus recognition［J］.Current Opinion in Immunology，2008，20（1）：17-22.

［10］孫文香，蔣爭凡.病毒感染引發(fā)天然免疫細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進展［J］.中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2013，35（5）：1-11.

［11］游艷，肖建華，廖勇.干擾素抗病毒作用機制的研究進展［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（11）：1795-1797.

［12］趙樸，鄭玉姝，喬傳玲，等.A型流感病毒逃避免疫應(yīng)答的策略［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2008，35（10）：1137-1141.

［13］張煜，鐘波，楊艷，等.TLRs與RLRs介導(dǎo)的細胞抗病毒反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機制［J］.細胞生物學(xué)雜志，2009，31（4）：453-468.