林江慧，張建偉，張惠芳，高建平，魏 崢

（福州大學(xué)糖生物化學(xué)研究所，福建福州 350002）

硫酸類肝素二糖的質(zhì)譜裂解規(guī)律探析

林江慧，張建偉，張惠芳，高建平，魏 崢

（福州大學(xué)糖生物化學(xué)研究所，福建福州 350002）

硫酸類肝素結(jié)構(gòu)決定了它與蛋白之間的相互作用，對(duì)硫酸類肝素結(jié)構(gòu)的解析，能夠進(jìn)一步闡明結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子阱－多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)（ESI－MSn）在負(fù)離子模式（ESI－）下探析了12種硫酸類肝素二糖的裂解規(guī)律。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：二糖中亞硫酸根的位置和數(shù)量對(duì)其在質(zhì)譜分析中的穩(wěn)定性起著決定作用，所含亞硫酸根越多越不穩(wěn)定；N位亞硫酸根比C—2位和C—6位亞硫酸根更容易丟失。此外，二級(jí)質(zhì)譜表明，同分異構(gòu)體有其特定的裂解規(guī)律。該質(zhì)譜裂解規(guī)律有助于硫酸類肝素二糖同分異構(gòu)體的鑒定，可為多級(jí)質(zhì)譜在硫酸類肝素結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

硫酸類肝素二糖；結(jié)構(gòu)；電噴霧離子阱－飛行時(shí)間質(zhì)譜；裂解規(guī)律

硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）是高度硫酸化線性糖胺聚糖，廣泛存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞基質(zhì)中。HS在生物體生長發(fā)育、血管生成、凝血、細(xì)胞粘附，以及腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要的生物學(xué)活性［1－5］，通過與酶、生長因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞基質(zhì)蛋白的相互作用調(diào)控眾多的細(xì)胞信號(hào)通路［6－8］。這些重要的生物功能主要是由HS的特殊序列結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)間的親和作用以及HS完整鏈的性質(zhì)決定的［9］。如C—6—O亞硫酸根是它與成纖維生長因子、血管生長因子相互作用的位點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)腫瘤血管生長［10］。含C—2—O亞硫酸根的硫酸類肝素十糖能抑制FGF－2信號(hào)通路［11］。N－非取代葡萄糖胺是病毒黏附、侵入細(xì)胞必要的結(jié)構(gòu)［12］。

HS是由重復(fù)二糖單元構(gòu)成的聚糖鏈。二糖是由己糖醛酸（hexuronic acid，HexA）和葡萄糖胺（glucosamine，GlcN）以1～4糖苷鍵連接而成的。其中己糖醛酸可能存在4種結(jié)構(gòu)，2種差向異構(gòu)體－葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）或艾杜糖醛酸（iduronic acid，IdoA），以及它們C—2—O位被硫酸化的衍生物。而葡萄糖胺的存在形式更為復(fù)雜，有N－乙酰葡萄糖胺（N－acetylglucosamin，GlcNAc）、N－硫酸化葡萄糖胺（N－sulfoglucosamin，GlcNS）和N－非取代葡萄糖胺（N－unsubstituted glucosamine，GlcNH），以及它們的C—6—O位和C—3—O位被硫酸化的衍生物。利用肝素酶酶解HS，能得到12種典型的硫酸類肝素二糖［12－16］，此類酶解產(chǎn)物的己糖醛酸中含有△4－，5－不飽和雙鍵。由于HS的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使其結(jié)構(gòu)組分研究極具挑戰(zhàn)。

鑒于HS具有重要的生物功能，測定HS的精細(xì)結(jié)構(gòu)是十分必要的。迄今為止，對(duì)HS結(jié)構(gòu)測定主要集中在二糖組分的分析，主要采用的方法有毛細(xì)管電泳法［17］、聚丙烯酰胺凝膠電泳法［18］和液相色譜［19］法。以上方法都存在靈敏度不高，測定生物來源樣品時(shí)雜質(zhì)干擾較大等缺點(diǎn)。近十幾年來，由于質(zhì)譜的高靈敏度和高分辨率，使其在硫酸類肝素結(jié)構(gòu)測定中的應(yīng)用受到重視。目前，已報(bào)道了利用多種液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用體系分析硫酸類肝素二糖和寡糖的結(jié)構(gòu)，如熒光標(biāo)記－反相色譜－質(zhì)譜體系［2021］、亞硝酸裂解－親水色譜－質(zhì)譜體系［22］、超壓液相色譜－電噴離子化質(zhì)譜體系［23－24］，另外也有采用串聯(lián)質(zhì)譜研究硫酸類肝素寡糖中亞硫酸根丟失的規(guī)律報(bào)道［25］。

本工作應(yīng)用電噴霧離子阱－多級(jí)質(zhì)譜法對(duì)12種硫酸類肝素二糖（肝素酶解產(chǎn)物）進(jìn)行分析，主要探討亞硫酸根對(duì)二糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響、同分異構(gòu)體的區(qū)分以及二糖的裂解規(guī)律，以期為多級(jí)質(zhì)譜在硫酸類肝素結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用提供理論結(jié)構(gòu)信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

離子阱飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；Mili－Q超純水機(jī)：美國Millpore公司產(chǎn)品；離心濃縮儀：德國Christ公司產(chǎn)品；12種硫酸類肝素二糖（肝素酶酶解產(chǎn)物）△HexA－GlcNH（A），△HexA2S－GlcNAc（B），△HexA－GlcNAc（C），△HexA－GlcNAc6S（D），△HexA2S－GlcNH（E），△HexA2S－GlcNH6S（F），△HexA－GlcNH6S（G），△HexA2S－GlcNS（H），△HexA－GlcNS（I），△HexA－GlcNS6S（J），△HexA2S－GlcNAc6S（K），△HexA2S－GlcNS6S（L）：均為英國Idruon公司產(chǎn)品；乙腈：德國Memmert公司產(chǎn)品；乙酸銨：美國Sigma公司產(chǎn)品。

1．2 質(zhì)譜條件

ESI源，負(fù)離子模式，霧化氣流速1．50L／min，干燥氣流速10L／min，加熱模塊溫度200℃，曲形脫溶劑管（CDL）溫度200℃，離子源電壓4．5kV，檢測器電壓1．6kV，累積時(shí)間20ms，質(zhì)量掃描范圍m／z50～700，碰撞能量95％。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確吸取10μL 50mg／L肝素二糖溶液，在負(fù)離子模式下，手動(dòng)注入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2．1 二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc負(fù)離子模式質(zhì)譜分析

二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的質(zhì)譜分析及裂解方式示于圖1。

△HexA－GlcNH準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－為m／z336．090 8，△HexA－GlcNAc的［M－H］－為m／z378．100 3。為了進(jìn)一步分析二糖的裂解規(guī)律，選擇m／z336．090 8進(jìn)行二糖△HexA－GlcNH

二級(jí)裂解，碰撞能量為95％。而二糖△HexAGlcNAc選擇m／z 378．100 3進(jìn)行二級(jí)裂解。兩種二糖都存在0，2X方式裂解，得到m／z 277．056 3，277．055 4碎片離子，以及0，2X方式裂解碎片失去一分子水后的到m／z259．045 7，259．045 9離子。兩種二糖都存在2Y裂解碎片離子，分別為m／z 175．025 5，175．025 7?！鱄exA－GlcNAc存在特別的裂解方式［MH2O－H］－為m／z 360．087 9。這2個(gè)二糖都不含亞硫酸根，在質(zhì)譜測試中，其結(jié)構(gòu)相對(duì)較穩(wěn)定，不存在鈉加合現(xiàn)象?！鱄exA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的質(zhì)譜裂解規(guī)律差別不明顯，主要原因是其結(jié)構(gòu)非常相似。

圖1 二糖△HexA－GlcNH和△HexA－GlcNAc的1、2級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律Fig．1 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA－GlcNH and△HexA－GlcNAc

2．2 二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S負(fù)離子模式質(zhì)譜分析

二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S的質(zhì)譜分析及裂解方式示于圖2。

二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－Glc－NAc6S為同分異構(gòu)體，準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－分別為m／z458．057 2和458．057 3。鈉加合得到［M＋Na－H］－分別為m／z480．037 4和480．038 7。一級(jí)質(zhì)譜中，△HexA2S－GlcNAc的2位亞硫酸根斷裂得到m／z 378．991 9離子，△HexAGlcNAc6S失去水分子得到m／z 440．047 8離子，失去6－位亞硫酸根得到m／z 378．992 7離子。這2個(gè)二糖的一級(jí)質(zhì)譜存在細(xì)微差別，在二級(jí)質(zhì)譜裂解中有自身規(guī)律。它們都存在0，2X，0，5X裂解方式，△HexA2S－GlcNAc0，2X斷裂失去一分子水得到碎片離子m／z259．998 2，△HexA－GlcNAc6S0，2X方式斷裂得到碎片離子m／z357．012 1。△HexA2S－GlcNAc的2位亞硫酸根裂解，同時(shí)發(fā)生0，5X斷裂失去一分子水得到碎片離子m／z300．037 3?！鱄exA－GlcNAc6S母離子6位亞硫酸根丟失，同時(shí)發(fā)生0，5X斷裂失去一分子水得到m／z300．037 3。NAcX方式斷裂失去一分子水得到m／z396．055 2。準(zhǔn)分子離子峰失去一分子水［M－H2O－H］－得到m／z440．048 8和440．047 3。

圖2 二糖△HexA2S－GlcNAc和△HexA－GlcNAc6S的1、2級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律Fig．2 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNAc and△HexA－GlcNAc6S

不同之處是△HexA2S－GlcNAc存在3Y裂解得到m／z157．018 0，母離子2位亞硫酸根丟失后，失去一分子水得到m／z 360．090 2。而△HexA－GlcNAc6S存在0，2X1Y斷裂產(chǎn)生m／z198．993 0，0，2Z裂解產(chǎn)生m／z342．048 2。

2．3 二糖△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的負(fù)離子模式質(zhì)譜分析

△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的質(zhì)譜分析及裂解方式示于圖3。

△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS三個(gè)二糖互為同分異構(gòu)體，準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－分別為m／z 416．045 7、416．046 0和416．046 2。在一級(jí)質(zhì)譜中，由于只含1個(gè)亞硫酸根，產(chǎn)生的離子碎片較少，這3個(gè)二糖不存在鈉加合現(xiàn)象?！鱄exA2S－GlcNH和△HexA－GlcNH6S存在少量的0，2X方式裂解碎片離子，而△HexA－GlcNS不存在。

△HexA2S－GlcNH選擇m／z416．045 7進(jìn)行二級(jí)裂解。母離子失去一分子水［M－H2OH］－得到m／z398．036 6。0，2X方式裂解得到m／z 357．011 9離子，0，2Z方式裂解得到m／z300．037 4。2位亞硫酸根斷裂同時(shí)0，2X裂解后，失去一分子水得到m／z 258．029 1。1Y裂解得到m／z 236．969，1，3Y方式斷裂得到m／z157．016 8。△HexA－Glc－NH6S選擇m／z416．046 0進(jìn)行二級(jí)裂解，失去一分子水得到［M－H2O－H］－m／z398．035 5。發(fā)生0，2X裂解得到m／z357．012 2，失去一分子水得到m／z338．998 3，0，2Z方式斷裂得到m／z 300．038 1。6位亞硫酸根斷裂同時(shí)0，2X斷裂后，失去一分子水得到m／z 258．028 8碎片離子。0，2X1Y斷裂產(chǎn)生m／z198．993 7碎片離子。二糖△HexA－GlcNS選取m／z 416．046 2進(jìn)行二級(jí)裂解，失去一分子水得到［M－H2O－H］－m／z398．035 2，失去亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z336．091 5。0，2Z方式斷裂得到m／z 300．039 5，1Y方式裂解失去一分子水得到m／z

137．990 2。△HexA2S－GlcNH和△HexA－Glc－NH6S的二級(jí)質(zhì)譜主要區(qū)別在于，△HexA2SGlcNH存在3Y裂解方式，而△HexA－GlcNS存在特定的碎片離子m／z137．990 2。

圖3 二糖△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S和△HexA－GlcNS的1、2級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律Fig．3 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNH，△HexA－GlcNH6S and△HexA－GlcNS

2．4 二糖△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的負(fù)離子模式質(zhì)譜分析

△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的質(zhì)譜分析及裂解方式示于圖4。

△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S三個(gè)二糖互為同分異構(gòu)體，準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－分別為m／z496．002 7、496．003 1和496．002 2。二糖分子中含有2個(gè)亞硫酸根，使分子結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜測定中不穩(wěn)定，一級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生的離子碎片較多，鈉加合得到［M＋Na－H］－分別為m／z 517．983 4、517．984 5和517．984 4?！鱄exA 2S－GlcN 6S

失去1個(gè)亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z 416．046 1，同時(shí)0，2X裂解得到m／z357．011 2。已報(bào)道的N位亞硫酸根丟失，比2位、6位亞硫酸根裂解過渡態(tài)能壘低12．6～33．5kJ／mol［26］。因此，△HexA2S－GlcNS失去N位亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z416．047 0，接著0，2X裂解得到m／z357．011 2。同樣，△HexA－GlcNS6S失去N位亞硫酸根得到［M－SO3－－H］－m／z 416．047 0，0，2X裂解得到m／z 357．019 4?！鱄exA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S出現(xiàn)帶2個(gè)電荷的準(zhǔn)分子離子峰［M－2H］2－m／z 247．497 9和247．497 8。而△HexA2S－GlcN6S二糖沒有出現(xiàn)，這可能與二糖游離氨基帶正電有關(guān)。

圖4 二糖△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS和△HexA－GlcNS6S的1，2級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律Fig．4 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcN6S，△HexA2S－GlcNS and△HexA－GlcNS6S

△HexA2S－GlcNS的二級(jí)裂解選取m／z 357．013 2，失去一分子水［M1－H2O－H］－得

到m／z 339．004 9碎片離子。2，4X裂解產(chǎn)生［M1－C2H4O2－H］－m／z 296．994 3，3Y方式裂解得到m／z 157．016 2。雖然△HexA2SGlcNH6S和△HexA2S－GlcNS的母離子不同，但都存在3Y裂解方式?！鱄exA2S－GlcNH6S存在0，2X1Y裂解方式，而△HexA2S－GlcNS有1Y裂解方式。△HexA－GlcNS6S有3Y裂解，同時(shí)失去一分子水。

2．5 二糖△HexA2S－GlcNS6S和△HexA2S－Glc－NAc6S負(fù)離子模式質(zhì)譜分析

△HexA2S－GlcNS6S和△HexA2S－GlcNAc6S的質(zhì)譜分析及裂解方式示于圖5。

△HexA2S－GlcNS6S的一級(jí)質(zhì)譜裂解方式較為復(fù)雜，準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－為m／z 575．962 4、鈉加合得到［M＋Na－H］－為m／z 597．944 4，亞硫酸根丟失［M－SO3－－H］－為m／z496．004 6，亞硫酸根丟失鈉加合離子碎片［M－SO3－＋Na－H］－為m／z517．986 6，0，2X裂解碎片為m／z 357．013 2。亞硫酸根丟失帶2個(gè)電荷離子碎片［M－SO3－－2H］2－為m／z 247．498 6，鈉加合現(xiàn)象明顯。

二級(jí)裂解0，2X裂解碎片離子為m／z 440．047 3，0，2X裂解同時(shí)丟失2個(gè)亞硫酸根，失去一分子水得到m／z259．042 2，3Y裂解碎片離子為m／z 157．016 6，1Y裂解碎片離子為m／z236．970 9。丟失1個(gè)硫酸根，0，2Z裂解得到m／z300．037 4；失去2個(gè)硫酸根，同時(shí)失去一分子水得到m／z 396．058 3，2Y裂解碎片離子為m／z342．048 7。

二糖△HexA2S－GlcNAc6S的準(zhǔn)分子離子峰［M－H］－為m／z 538．013 1，一級(jí)質(zhì)譜碎片較多，出現(xiàn)鈉加合峰m／z559．995 4。6位氧亞硫酸根裂解后得到m／z458．057 8，它的鈉離子加合m／z480．930 8接著失去一分子水，得到m／z 440．047 5，2個(gè)電荷離子峰［M－2H］2－為m／z 268．502 8。

圖5 二糖△HexA2S－GlcNS6S and△HexA2S－GlcNAc6S的1，2級(jí)質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律Fig．5 MS1，MS2spectra data and fragmentation patterns of△HexA2S－GlcNS6S and△HexA2S－GlcNAc6S

二級(jí)裂解6－位氧亞硫酸根斷裂，同時(shí)0，2X裂解失去一分子水得到m／z339．004 9，2，4X裂解得到碎片離子m／z 296．993 4，3Y裂解得到碎片離子m／z157．016 2。

通過計(jì)算12種硫酸類肝素二糖在負(fù)離子模式下理論m／z與測試m／z的偏差，可直觀了解質(zhì)譜測試的精確度，結(jié)果列于表1。經(jīng)計(jì)算，偏差范圍在－10．6×10－6～－3．0×10－6之間。

表1 硫酸類肝素二糖的質(zhì)荷比及偏差Table 1 The m／z and error values of heparan sulfate disaccharide

一級(jí)質(zhì)譜結(jié)果表明，含有2個(gè)和3個(gè)亞硫酸根的二糖都不穩(wěn)定，易產(chǎn)生亞硫酸根的丟失。除△HexA2S－GlcNH6S外，其他二糖都帶2個(gè)電荷碎片離子?！鱄exA2S－GlcNS6S二糖含有3個(gè)亞硫酸根，在質(zhì)譜測試中最不穩(wěn)定。在一級(jí)質(zhì)譜中，N位亞硫酸根最容易裂解，其次是6位氧亞硫酸根，2位氧亞硫酸根。此外，葡萄糖胺殘基出現(xiàn)環(huán)內(nèi)斷裂。含有1個(gè)亞硫酸根的二糖，不論是氧位硫酸化還是N位硫酸化，質(zhì)譜中的分子結(jié)構(gòu)都比較穩(wěn)定。在帶1個(gè)電荷狀態(tài)下，亞硫酸根丟失較多，帶2個(gè)電荷下，亞硫酸根丟失較少，亞硫酸根丟失是一個(gè)主要的裂解方式。二糖△HexA2SGlcN、△HexA－GlcNS6S和△HexA2S－GlcNS6S容易產(chǎn)生帶2個(gè)電荷的準(zhǔn)分子離子峰［M－2H］2－，△HexA－GlcNS則沒有。N－乙?；恰鱄exA2SGlcNAc、△HexA－GlcNAc、△HexA2S－GlcNAc6S和△HexA－GlcNAc6S中只有△HexA2S－GlcNAc6S存在帶2個(gè)電荷的準(zhǔn)分子離子峰，4個(gè)帶游離氨基的二糖則沒有，這說明高硫二糖容易出現(xiàn)帶2個(gè)電荷的準(zhǔn)分子離子峰，同時(shí)還與電荷分布有關(guān)。

3 結(jié)論

分子電荷狀態(tài)和陽離子加合現(xiàn)象決定了硫酸類肝素質(zhì)譜負(fù)離子模式中亞硫酸根丟失和糖骨架斷裂。在質(zhì)譜測試中，二糖中亞硫酸根的位點(diǎn)和數(shù)量影響結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，所含亞硫酸根越多越不穩(wěn)定。N位亞硫酸根比O位亞硫酸根更容易裂解，二級(jí)質(zhì)譜測定中二糖結(jié)構(gòu)斷裂有相似之處，但也有自身的特點(diǎn)。因此，在分析復(fù)雜的生物樣品時(shí)，可以利用二級(jí)質(zhì)譜更精確地定性和定量分析同分異構(gòu)體，這可為生物樣品糖組學(xué)的研究提供高精確度的分析手段。

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Study on the Fragmentation Patterns of Heparan Sulfate Disaccharides by ESI－MS

LIN Jiang－h(huán)ui，ZHANG Jian－wei，ZHANG Hui－fang，GAO Jian－ping，WEI Zheng
（Institute of Glycobiochemistry，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou350002，China）

The structure of heparan sulfate determines its interaction with proteins，therefore the analysis of heparan sulfate can help further clarify structure and function relationships．The characteristic fragmentation pattern of twelve heparan sulfate disaccharide was discussed by electrospray ionization－ion trap mass spectrometry（ESI－MSn）in negative mode．The results show that the position and quantity of sulfate groups in disaccharide determine its stability in MS，moreover，C—2sulfate and C—6sulfate in disaccharide are more stable than N－sulfate．MS2revealed that the disaccharide isomers have a characteristic fragment pattern．The results may contribute to identify the disaccharides isomer of heparan sulfate，which can provide theoretical knowleage to identify the structural of heparan sulfate．

heparan sulfate disaccharides；structure；electrospray ionization－ion traptime flight mass spectrometry；fragmentation patterns

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0111－09

10．7538／zpxb．youxian．2014．0059

2014－03－10；

2014－06－02

國家自然科學(xué)基金（21343013）；國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目（1103303）資助

林江慧（1981—），男（漢族），福建寧德人，糖生物化學(xué)專業(yè)。E－mail：linjianghui＠fzu．edu．cn

魏 崢（1969—），女（漢族），福建福州人，教授，從事糖生物化學(xué)、分析化學(xué)研究。E－mail：weizheng＠fzu．edu．cn

時(shí)間：2014－12－02；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0059．html