付松 郎冰 李云鴻 王銀

摘要：本文為研究熱休克蛋白60（HSP60）在枸杞多糖（LBPs）神經(jīng)保護中的作用機制，采用的方法是培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞株BV2，實驗分對照組、陽性對照組（細菌脂多糖，LPS）、實驗組（LBPs）。應(yīng)用western-blot檢測LBPs對LPS激活的BV2細胞HSP60和Toll樣受體4（TLR-4）的影響，ELISA方法檢測LBPs對HSP60釋放和細胞因子產(chǎn)生的作用。結(jié)果顯示，LPS組中HSP60和TLR-4的表達及TNF-α和IL-1β的釋放都比對照組顯著增加，加入LBPs后，這些因子的水平都明顯降低。由此得出結(jié)論，LBPs可能通過HSP60-TLR-4途徑阻止小膠質(zhì)細胞的活化而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

關(guān)鍵詞：熱休克蛋白60;枸杞多糖;TLR-4;小膠質(zhì)細胞

中圖分類號：G642 ? ? 文獻標(biāo)志碼：A ? ? 文章編號：1674-9324（2015）47-0247-02

熱休克蛋白是一類應(yīng)激蛋白，對機體具有保護作用。但是近年來的研究表明，細胞內(nèi)過量表達的熱休克蛋白60（HSP60）會釋放到胞外，激活自身的Toll樣受體-4（TLR-4），導(dǎo)致TLR-4信號通路激活，引起細胞凋亡[1，2]。枸杞是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，尤其以寧夏枸杞最為著名，素有“紅寶”美稱。枸杞多糖（LBPs）是從枸杞中提取的一種水溶性多糖，是枸杞的主要活性成分，具有降血脂、抗脂肪肝、抗衰老、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[3]。雖然LBPs的生物和藥理作用已為人們逐漸認(rèn)識，但是，關(guān)于LBPs對神經(jīng)系統(tǒng)的作用的研究還很少有報道。本課題以小膠質(zhì)細胞為靶細胞，探討了LBPs對細菌脂多糖（LPS）激活的小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)保護作用及其信號通路。

一、材料與方法

（一）材料

枸杞多糖購自寧夏啟元藥業(yè);HSP60抗體購自ENZO公司;TLR-4及GAPDH抗體購自Abcam公司;全蛋白提取試劑盒購自凱基公司;蛋白定量BCA試劑盒購自Thermo公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品;LPS購自Sigma公司;ELISA試劑盒購自欣博盛公司。

（二）方法

1.BV2小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)。BV2小膠質(zhì)細胞在含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用無菌的0.01%PBS充分溶解枸杞多糖。LPS（1μg/ml）處理BV2小膠質(zhì)細胞30min后，分別加入600μg/ml的枸杞多糖溶液，孵育24小時后，收集細胞及上清液。

2.Western blot檢測蛋白表達。藥物處理完畢，用全蛋白提取試劑盒提取各組蛋白并收集上清液，BCA法進行蛋白定量，取等量蛋白，10% SDS-PAGE分離后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜2h，一抗4℃孵育過夜，TBST充分洗滌膜后用二抗室溫孵育1 h，ECL試劑顯色成像。以GAPDH作為內(nèi)參照。

3.ELISA檢測細胞因子的表達。應(yīng)用ELISA試劑盒，按照試劑盒的操作步驟，分別測定各組培養(yǎng)液上清中的TNF-α、IL-1β的表達，最后在酶標(biāo)儀上540nm處測定各孔光密度值（OD）。

4.統(tǒng)計學(xué)分析。采用SPSS11.5進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較用方差分析，進一步比較兩兩間差異采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

二、結(jié)果

（一）枸杞多糖抑制LPS激活后的小膠質(zhì)細胞中的HSP60的表達及釋放

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比較，LPS激活后的小膠質(zhì)細胞中HSP60的表達明顯上揚，而枸杞多糖可顯著抑制LPS引起的HSP60的增加，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1A）。ELISA結(jié)果顯示枸杞多糖處理后，由LPS引起的HSP60的胞外釋放量明顯地被降低了（圖1B）。

A為western blot結(jié)果，實驗分為對照（con），LPS組，實驗組LBPs，以GAPDH為內(nèi)參。B為枸杞多糖處理24小時后，ELISA檢測的細胞培養(yǎng)液中HSP60水平。各組實驗中，LPS組相對于con，均具有顯著性差異。枸杞多糖實驗組相對于LPS組，具有顯著性差異，p<0.05.

（二）枸杞多糖抑制激活的小膠質(zhì)細胞中的TLR-4的表達

Western blot結(jié)果表明，與對照組相比較，LPS處理后的小膠質(zhì)細胞中TLR-4的表達明顯增加，在枸杞多糖處理的實驗組中，TLR-4的表達顯著下降，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

（三）枸杞多糖抑制了激活的小膠質(zhì)細胞的細胞因子的表達

用ELISA試劑盒檢測了不同分組中TNF-α、IL-1β細胞因子的表達。實驗結(jié)果表明，LPS刺激后的BV2小膠質(zhì)細胞中的TNF-α、IL-1β細胞因子的表達顯著增加，而用枸杞多糖處理后細胞因子的水平降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。

三、討論

熱休克蛋白是一類應(yīng)激蛋白，對機體主要起著保護作用。但是近年來發(fā)現(xiàn)HSP60對細胞凋亡具有雙重作用。心臟衰竭的心肌細胞中HSP60的表達和定位發(fā)生了改變，導(dǎo)致心肌細胞的凋亡就是一個證據(jù)[2，4]。Kim等的研究發(fā)現(xiàn)異常定位到心肌細胞胞外的HSP60是TLR-4的配體，可以通過與TLR-4結(jié)合激活細胞凋亡通路[5]。但是迄今為止，關(guān)于HSP60在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用的報道還很少。

小膠質(zhì)細胞在受到感染等因素刺激后迅速活化，產(chǎn)生多種促炎因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?nèi)缗两鹕Y、老年癡呆癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥等的主要因素[5]。TLR-4可以識別細胞釋放至胞外的HSP60，因此我們假設(shè)激活后的小膠質(zhì)細胞大量表達HSP60，并將其釋放至胞外。胞外的HSP60與小膠質(zhì)細胞膜上的TLR-4受體結(jié)合，激活TLR-4信號通路，介導(dǎo)各種炎癥因子的釋放，導(dǎo)致周圍神經(jīng)元和其他神經(jīng)膠質(zhì)細胞的損傷。我們的實驗證實了此推測，小膠質(zhì)細胞經(jīng)LPS激活后，胞內(nèi)HSP60的表達顯著上升，胞外也檢測到大量HSP60，并提高了TLR-4的表達及炎癥因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。這些結(jié)果與文獻中心肌細胞HSP60的作用機制一致，說明激活的小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的HSP60可作為內(nèi)源性配體進一步激活小膠質(zhì)細胞的TLR-4信號通路導(dǎo)致自身的凋亡。

目前對于神經(jīng)退行性疾病治療的研究工作有很大一部分是針對抑制小膠質(zhì)細胞活化和細胞炎性因子的產(chǎn)生，因此尋找合適的藥物至關(guān)重要。枸杞多糖具有多種生物活性，但是其對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用還知之甚少。我們前期的研究顯示LBPs可以通過抑制小膠質(zhì)細胞中HSP60的表達及釋放來抑制其凋亡，但機制尚不明了[6]。本實驗中，我們證實了激活的小膠質(zhì)細胞釋放的HSP60可能是通過抑制TLR-4信號通路來保護細胞的。其具體過程可能是由于LBPs抑制了小膠質(zhì)細胞膜上TLR-4的表達，從而阻斷HSP60與TLR-4的結(jié)合，進而抑制TLR-4信號通路炎性因子的釋放而完成的。本次實驗結(jié)果表明，枸杞多糖能有效抑制LPS激活的小膠質(zhì)細胞的激活，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病的預(yù)防及治療有著良好的應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1]Gupta S，Knowlton A A.HSP60，Bax，apoptosis and the heart [R].J Cell Mol Med，2005，9（1）：51.

[2]Lin L，Kim S C，Wang Y，Knowlton A A.HSP60 in heart failure：abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293（4）：H2238.

[3]王琦，張曉丹，張靜蕾.枸杞多糖研究進展[R].食品研究與開發(fā)，2009，30（10）：150.

[4]Kim SC，Stice JP，Chen L，Knowlton A A.Extracellular heat shock protein 60，cardiac myocytes，and apoptosis[J].Circ Res，2009，105：1186-1195.

[5]Gonzalez-Scarano F， Baltuch G. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases[J].Annu Rev Neurosci，1999，22：219-40.

[6]Teng P， Li YH， Cheng WJ， Zhou L，Shen Y，Wang Y.Neuroprotective effects of Lycium barbarum polysaccharides in lipopolysaccharide-induced BV2 microglia cells[J].Molecular Medicine Reports，2013，7：1977-1981.