邸仕忠，孫小紅，羅永統(tǒng)，陳維竟，彭福英，彭福佳，楊 飛

（1.重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特種作物研究所，重慶 涪陵 408000；2.長江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 涪陵 408100）

近年來，隨著國家調(diào)整玉米產(chǎn)業(yè)體系相關(guān)政策方針的出臺(tái)，“國務(wù)院關(guān)于加快推進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)作物種業(yè)發(fā)展的意見（2011國務(wù)院8號(hào)文件）”的實(shí)施和推進(jìn)，及大量國外種業(yè)巨頭進(jìn)入中國，玉米育種競爭趨于白熱化，各育種單位均在積極進(jìn)行材料創(chuàng)新［1］.但我國玉米育種長期依賴于少數(shù)骨干材料，新選的自交系和雜交種同質(zhì)化嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)個(gè)別單位和個(gè)人盜取他人親本、雜交種套牌等不良現(xiàn)象［2－4］.因此，在進(jìn)行自交系選育的同時(shí)，利用分子標(biāo)記檢測其遺傳多樣性，構(gòu)建自交系的DNA指紋圖譜，不僅可以了解材料間的遺傳基礎(chǔ)、親緣關(guān)系和雜優(yōu)類群，還可以保護(hù)自交系的品種權(quán)免受侵犯［5］.SSR（simple sequence repeat）技術(shù)因其信息含量高、呈共顯性、易于操作等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于許多作物的DNA指紋圖譜構(gòu)建［2－4］.譚君［6］、趙久然等［7－9］分別對西南地區(qū)玉米自交系和中國玉米新品種進(jìn)行了 DNA 指紋庫建立，初步建立了一套適用于自交系和玉米品種鑒定的SSR標(biāo)準(zhǔn)體系，但未見重慶地區(qū)玉米自交系DNA指紋圖譜方面的研究.作者利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建重慶市部分常用及新選育優(yōu)良自交系的指紋圖譜，分析其遺傳多樣性，為自交系的改良提供依據(jù)并為保護(hù)其知識(shí)產(chǎn)權(quán)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用重慶市渝東南農(nóng)科院新選自交系61份，各亞群代表自交系5個(gè)，自交系名稱編號(hào)見表1.

表1 66個(gè)自交系名稱及編號(hào)Tab.1 The materials used in study and their resource

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

采用砂培法培養(yǎng)玉米幼苗，每個(gè)樣品取15株葉片混合后，采用2×CTAB法提取并純化基因組 DNA［11］.

1.2.2 PCR擴(kuò)增

采用10μL PCR體系，包括1×buffer，2.5μmol·L－1MgCl2、150μmol·L－1dNTPs、0.2μmol·L－1引物、1UTaq酶和100ng DNA模板.將反應(yīng)液在振蕩器混勻后，加入20μL液體石蠟覆蓋.反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃預(yù)變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，12℃保存.

1.2.3 電泳、銀染

在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μL 3×SGB（98%去離子甲酰胺；10mM EDTA，pH 8.0；0.025%溴酚藍(lán)；0.025%二甲苯青）.每個(gè)樣取4.5μL，在1×TBE緩沖液條件下，用6%的聚丙烯酰胺變性的凝膠進(jìn)行電泳，恒定功率75W預(yù)電泳約30rain，75W電泳約1h.銀染參照辛景樹［9］的程序進(jìn)行.

1.2.4 引物的選擇

結(jié)合已有的研究基礎(chǔ)，參照北京市玉米親本鑒定地方標(biāo)準(zhǔn)“DB11／T 507－2007”中玉米品種純度及真實(shí)性SSR分子檢測方法，選擇40對SSR核心引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，對表現(xiàn)出多態(tài)性的擴(kuò)增帶數(shù)量化：在相同遷移位置有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失數(shù)據(jù)記為“9”，建立數(shù)據(jù)庫.以簡單相配系數(shù)（simple matching coefficient，簡稱SM）計(jì)算自交系的遺傳相似值（genetic similarity，簡稱GS）［10］.GS＝m／（m＋n），m表示基因型共有帶數(shù)目；n表示基因型間差異帶數(shù)目.利用 NTSYS－pc version 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，按 UPGMA方法（un－weighted pair group method using arithmetic averages）對供試自交系進(jìn)行聚類.每個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息（polymorphism information contention）按Smith等［11］的公式計(jì)算，即 PIC＝1－∑fi2，其中fi表示位點(diǎn)的基因頻率.

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記檢測結(jié)果

40對SSR核心引物中，32對PCR條帶清晰、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高.以此32對引物對66個(gè)玉米自交系進(jìn)行PCR擴(kuò)展及檢測，結(jié)果表明，在66個(gè)自交系中共檢測出155個(gè)條帶，每對引物檢測到條帶2～12個(gè)，平均為4.84個(gè)，其中多態(tài)性條帶占100%.每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC值）變幅為0.516～0.988，平均為0.721，其中引物bnlg2305的PIC最大，為0.988；引物umc2007的PIC最小，為0.516.擴(kuò)增條帶數(shù)和PIC值結(jié)果見表2.供試自交系中遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.54～0.88，平均值為0.68，多數(shù)遺傳相似系數(shù)都大于0.60，遺傳相似系數(shù)在0.60～0.70間分布最多，占60.33%.說明供試材料間有一定的遺傳差異.

表2 32對SSR引物在66個(gè)玉米自交系中檢測到的等位基因數(shù)、PIC值Tab.2 The number of alleles and PIC in the 66maize lines detected by 32pairs of SSR primer

續(xù)表2

2.2 引物的確定

評價(jià)32對引物在66份自交系間的帶型清晰度、多態(tài)性高低和帶型統(tǒng)計(jì)的難易程度，作為最終構(gòu)建指紋圖譜的候選引物.再根據(jù)入選引物在每條染色體上均勻分布的原則，最終確定umc2105k3、phi072k4、umc1545y2、umc1125y3、phi080k15、umc1506k12、bnlg249k2、phi299852y2、umc1936k4 和bnlg2235y5等10對引物作為供試玉米自交系指紋圖譜構(gòu)建的引物.10對引物對66個(gè)玉米自交系的檢測結(jié)果表明，10對引物共檢測出31個(gè)條帶，每對引物檢測到條帶3～4個(gè)，平均為3.10個(gè)，其中多態(tài)性條帶占100%，phi072k4條帶數(shù)最多為5個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC值）變幅為0.487～0.723，平均為0.651，說明這套引物具有較好的鑒別能力.圖1為引物umc2105不同條帶的帶型圖.

2.3 親本的指紋圖譜及數(shù)字化

利用10對引物對66份玉米代表品種構(gòu)建指紋圖譜，特征條帶長度在149～432bp，轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋.66份玉米自交系間，相似系數(shù)在0.29～0.94之間，平均值為0.62.聚類分析表明，10對引物可將66份玉米自交系區(qū)分開來.根據(jù)趙久然等［8］提出假設(shè)同一引物的不同擴(kuò)增帶型的基因頻率相同，即同一引物的不同等位基因等頻率出現(xiàn)的條件下，如果某個(gè)引物對的等位基因數(shù)是n，則該引物理論上可區(qū)分的最大自交系數(shù)為N＝n，最大雜交種數(shù)N＝1／2n（n＋1），出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P＝－I／N.該研究中確定的一套10個(gè)核心引物組合可區(qū)分的最大自交系數(shù)N＝N1×N2×…×N10＝10×6×6×6×6×6×6×6×6×6＝1.01×108，出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P＝9.29×10－9.因此，可以利用這套引物構(gòu)建重慶主要玉米自交系指紋.將篩選到的10對引物所擴(kuò)增的片段數(shù)字化，使每一個(gè)親本的指紋圖譜都用相應(yīng)的數(shù)字表示構(gòu)成系譜各世代親本的身份證號(hào)碼，可以用于該自交系的真?zhèn)舞b定，結(jié)果列于表3.

表3 66份玉米自交系的數(shù)字化DNA指紋圖譜Tab.3 Digitizing DNA fingerprint of 66maize lines used in this study

續(xù)表3

3 討 論

近年來，隨著國家相關(guān)政策方針的出臺(tái)，加之大量國外種業(yè)巨頭進(jìn)入中國，對玉米新品種權(quán)的保護(hù)及玉米品種的真實(shí)性和純度鑒定要求越來越高.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在玉米品種親緣關(guān)系和分類研究、品種的真實(shí)性和純度鑒定、新品種指紋圖譜構(gòu)建、新品種的區(qū)試DUS測試、區(qū)試品種質(zhì)量監(jiān)控等方面得到廣泛的應(yīng)用，并發(fā)揮著越來越重要的作用［9］，目前已建立大量玉米自交系及雜交種的DNA指紋圖譜.譚君等［6］利用20對引物構(gòu)建了西南地區(qū)常用的73份玉米自交系的SSR指紋圖譜.趙久然、辛景樹［7－8，10］等利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了中國部分玉米新品種DNA指紋庫.李麗華等［11］利用9對SSR引物構(gòu)建了四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所20個(gè)玉米自交系的指紋圖譜.王偉等［12］利用20對SSR構(gòu)建了貴州省2000年以來審定的48個(gè)玉米雜交種及其親本的指紋圖譜.邱紅波等［13］利用6對SSR引物構(gòu)建了36份喀斯特高海拔山區(qū)玉米骨干自交系的指紋圖譜.劉濤等［14］利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究了黔東南地方玉米品種，利用4對多態(tài)信息量高的引物建立了21個(gè)地方品種的DNA指紋圖譜.蓋樹鵬等［15］分別利用10對和20對適于玉米自交系和雜交種分析的核心引物，構(gòu)建了山東省35份骨干自交系和19份主栽雜交種的SSR指紋圖譜.該文作者的試驗(yàn)結(jié)果表明，32對引物在66個(gè)玉米自交系中共檢測出155個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶占100%，平均多態(tài)性信息量為0.721，說明供試材料間有一定的遺傳差異.確定10對SSR引物作為核心引物構(gòu)建了重慶66份玉米自交系的指紋圖譜.這10對引物的擴(kuò)增條帶均為3～4條，多數(shù)為3條，帶型統(tǒng)計(jì)簡單，可區(qū)分的最大自交系數(shù)N＝1.01×108，出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率P＝9.29×10－9，檢測66份自交系的DNA指紋圖譜沒有任何兩份帶型完全相同.證明利用這10對引物自交系的鑒定是可行有效的，可用于重慶地區(qū)玉米自交系鑒定.但篩選出的10對核心引物與譚君、李麗華、王偉、邱紅波、劉濤和蓋樹鵬等篩選的引物均存在差異，這可能與不同地區(qū)不同的玉米材料多態(tài)性存在差異有關(guān).而關(guān)于如何確定最佳的引物組合，至今沒有統(tǒng)一的觀點(diǎn)，關(guān)于重慶地區(qū)玉米材料最佳的核心引物組合有待選取更多的自交系材料進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步篩選適合于重慶地區(qū)的最佳核心引物.

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