趙良元，陶晶祥，劉 敏

(長江科學院a.流域水環(huán)境研究所;b.流域水資源與生態(tài)環(huán)境科學湖北省重點實驗室，武漢 430010)

1 研究背景

根際環(huán)境是指植物根周圍幾微米到幾毫米的微觀界面，是植物根系－環(huán)境－根際微生物相互作用的場所［1－2］。植物根系可為微生物提供大量繁殖的附著環(huán)境，根際釋放的氧氣可提高微生物的新陳代謝［3－4］，根系向外界環(huán)境(土壤、水體、沉積物)中分泌根系分泌物可為根際微生物提供豐富的營養(yǎng)及碳源，不同的根系分泌物又會產生不同的根際微生物群落結構［5］。因此，在植物根際環(huán)境中有著較為豐富的微生物數(shù)量，較強的微生物活力以及與非根際環(huán)境相比顯著差異的微生物群落結構［2，4］。

以植物根際微生物降解為主要機制的植物修復技術以其綠色、原位、可持續(xù)的修復特點成為近年來環(huán)境修復領域的熱點技術［6］。目前，大量研究報道了有機污染土壤或沉積物植物修復過程中根際微生物發(fā)揮的重要作用，如在多環(huán)芳烴、石油類污染物、多氯聯(lián)苯等有機污染物的修復過程中，修復植物根際微生物數(shù)量及活力提高了數(shù)倍至數(shù)十倍，根際效應明顯［7－9］。同時，植物可改變土壤或沉積物中的微生物群落結構，使得可以降解有機污染物的特定微生物類群大量繁殖。因此，研究植物根際微生物群落多樣性對于揭示植物根際效應機制尤為重要。

目前，關于微生物群落多樣性研究多集中在有機及無機污染物對土壤微生物群落結構的影響方面［10－11］，而關于植物修復過程中微生物的研究主要集中在微生物數(shù)量及活力研究［6－9］，對于有機及無機污染土壤/沉積物的植物修復過程中植物對土壤或沉積物微生物群落多樣性的研究較少。本試驗采用可用于分析整個微生物群落、表征微生物群落的功能潛力的方法——Biolog分析技術［12］，以挺水植物菖蒲(Acorus calamus L.)為對象，研究了水生植物對沉積物微生物群落功能多樣性的影響，為揭示水生植物對水環(huán)境沉積物的根際效應機制提供一定的科學依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

本試驗所用沉積物采自本地湖泊，為砂質沉積物。水生植物為野外湖泊采回并馴化后的菖蒲(Acorus calamus L.)，選取15～30 cm的幼株作為試供植物。試驗所使用的儀器為美國Biolog公司生產的GEN III MicroStation自動快速微生物鑒定系統(tǒng)，微生物碳源測定板為Biolog Eco板(生態(tài)板)。

2.2 根際效應試驗

沉積物經(jīng)預風干、研磨、過篩后，選取0.3～0.5 mm的粒度沉積物作為試驗用沉積物，定量稱取15 kg試驗用沉積物至水生植物培養(yǎng)箱內(0.5 m×0.4 m ×0.6 m)，加入自來水后放置 3～4 d，待沉積物有一定的硬度后再將初始株高一致(約30 cm)的菖蒲移栽入試驗的培養(yǎng)箱中，每個培養(yǎng)箱中種植10株。本試驗設置2種處理:非根際沉積物不栽培菖蒲;根際沉積物栽培水生植物菖蒲，每種處理設置3個平行。水生植物栽培時間為90 d，從2014年7月開始至2014年10月結束，在水生植物栽培期間，維持培養(yǎng)箱中水層高于沉積物層3～5 cm［13］。菖蒲栽培過程中生長良好。栽培試驗結束后取非根際及菖蒲根際沉積物，將各處理的3個平行樣品混合后進行微生物群落多樣性分析。

2.3 微生物碳源測定板碳源的分類

試驗使用美國Biolog公司生產的Biolog-Eco測試板，Eco板上一共分布96個孔，測試板上除了不含任何碳源的對照(水)以外，共31種碳源，每一種碳源有3個平行［14］。Biolog-Eco除對照以外的碳源孔中含有1種碳源和四氮唑藍，當微生物利用Eco板碳源進行生長呼吸可將四氮唑藍從無色還原成紫色，顏色深淺代表微生物對這種碳源的利用程度高低［15］。通過測定各板孔的吸光值及其變化來反映微生物群落代謝功能的多樣性［12］。

2.4 微生物群落對碳源代謝的測定

取水生植物根際及非根際新鮮沉積物約10 g，放入含90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，在于空氣浴恒溫振蕩器振蕩30 min(25℃，200 rpm)，靜置15 min，取上清液稀釋到1/10濃度，稀釋液經(jīng)3 500 rpm離心去除殘留的沉積物后(盡量減少沉積物原有碳源干擾)，吸取150μL上清液接入Biolog-Eco板中25℃下恒溫培養(yǎng)6 d，分別在24，48，72，96，120，144 h，用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)在波長為750 nm 及 590 nm 下測定吸光值［16－17］。

2.5 沉積物微生物群落多樣性計算

微生物群落功能多樣性指數(shù)計算公式參照文獻［18－20］:

(1)沉積物微生物群落總活性(AWCD)計算公式為AWCD=Σ(Ci－R)/n。

(2)豐富度指數(shù)S為每孔中(C－R)的值大于0.25的孔個數(shù)。

(3)Shannon-Wiener指數(shù) H'=－Σ(Pi·log Pi)。

(4)Simpson指數(shù)D=1－ΣPi2。

(5)Pielou均勻度指數(shù)E=H'/ln S。

其中，Ci為31個碳源孔的吸光值;R為對照孔的吸光值;n為31;Pi為有培養(yǎng)基的孔和對照孔的光密度值差與整板總差的比值，即Pi=(Ci－R)/Σ(Ci－R);S為被利用的碳源總數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件 SPSS v16.0及Graph-Pad Prism 5進行繪圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。用單因素方差分析(One-way ANOVA，Tukey’s Multiple Comparison Test)比較各大類碳源之間的差異，t檢驗比較各處理組與對照之間的差異，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著［13］，文中所有數(shù)據(jù)用 3 個平行的平均值表示。

3 結果與分析

3.1 沉積物微生物總活性

沉積物微生物總活性可用AWCD(Average Well Color Development)，即Biolog-Eco測試板孔中溶液吸光值平均變化率表征，是沉積物微生物群落利用單一碳源能力的一個重要指標［21－22］。從圖1可以看出，在168 h的培養(yǎng)時間內，根際及非根際微生物活性的總體變化趨勢為在前120 h內AWCD逐漸增大，120 h后AWCD緩慢降低。對于非根際來講，其AWCD在開始的24 h變化不大(p＞0.05)，而在第24～72 h內快速升高，在隨后的96～120 h內快速升高，然后緩慢降低(120～144 h)。根際AWCD表現(xiàn)出了0～48 h內快速升高，48～120 h內變化速度明顯減慢，隨后緩慢降低直到試驗結束。以120 h的AWCD值作為衡量微生物活性在根際及非根際環(huán)境下的變化情況，根際AWCD較非根際AWCD的變化速度(斜率)和最終AWCD均有較大程度的提高，而根際微生物群落的酶聯(lián)反應速度和最終能達到的程度，與群落能利用單一碳底物的微生物的數(shù)目和種類有關［23］。上述結果說明水生植物的種植可顯著提高沉積物中微生物的活力及功能多樣性。

圖1 168 h內培養(yǎng)過程中的AWCD變化Fig.1 Variation of AWCD in 168 h

3.2 沉積物微生物碳源利用特征

Biolog-Eco板含有31種不同種類的碳源，本文將這些碳源分為糖類、氨基酸類、酸類、醇類、胺類及酯類共6大類，每一大類的碳源數(shù)量及種類見表1所示。

表1 Biolog-Eco測試板31種碳源分類Table 1 Classification of 31 carbon sources in Biolog-Eco test plate

圖2為非根際及菖蒲根際沉積物微生物對Biolog-Eco板上6大類碳源的利用特征。非根際沉積物微生物對酯類碳源的利用程度最高(54.25%)，其次是胺類(15.27%)，對氨基酸類及羧酸類的利用程度較低(9.67%及9.93%)，對糖類及醇類利用程度最低(6.28% 及4.59%)，這說明非根際沉積物中優(yōu)勢微生物是一些以酯類及胺類為主要碳源的微生物。

水生植物菖蒲的種植大大促進了沉積物中微生物的生長，其對6大類碳源的利用程度除了酯類以外，其他5類具有較大幅度的提高，比非根際沉積物微生物對糖類、氨基酸類、羧酸類、醇類及胺類提高了110%～698%。根際沉積物微生物對酯類及糖類的利用程度最高，分別達到22.03% 及20.22%，其次是氨基酸類(16.02%)及 醇 類 (15.96%)，對 胺 類(12.93%)及羧酸類(12.82%)的利用程度最低。

以上結果說明，水生植物菖蒲可通過根系向沉積物分泌如碳水化合物、有機酸、氨基酸類等物質，促進能利用這些碳源的微生物大量繁殖，從而使得根際沉積物微生物對這幾類碳源的利用程度大大提高，整體提高了根際沉積物微生物的總活性。

圖2 非根際沉積物及菖蒲根際沉積物微生物對6大類碳源的利用程度Fig.2 Relative use efficiency of 6 carbon sources by microbial community in non-rhizosphere sediment and rhizosphere sediment of Acorus calamus L.

圖3 非根際沉積物中微生物對31種碳源的利用情況Fig.3 Relative use efficiency of 31 carbon sources by microbial community in non-rhizosphere sediment

3.3 沉積物微生物對31種碳源的利用情況

從圖3及圖4可以看出，對于糖類碳源來講，菖蒲根際沉積物微生物主要利用 D-纖維二糖、a-D-乳糖、β-甲基 D-葡萄糖苷及葡萄糖-1-磷酸，而非根際沉積物對于這些糖類基本不利用，只對a-D-乳糖有較少程度的利用，這說明菖蒲根際可能產生了新的微生物種類［24］，這些新的微生物可利用D-纖維二糖、a-D-乳糖、β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸作為碳源。

對于氨基酸類碳源來講，L-天冬酰胺酸、L-精氨酸及甘氨酰-L-谷氨酸對非根際沉積物的貢獻最大，但是利用程度不高;菖蒲根際氨基酸類總效應顯著提高主要是由L-天冬酰胺酸、L-絲氨酸及甘氨酰-L-谷氨酸這3類碳源引起，這幾類碳源利用效率比非根際沉積物提高了4～13倍。

對于酸類碳源來講，非根際對衣康酸、a-丁酮酸有較少程度的利用，而菖蒲根際則完全沒有利用，說明根際對利用衣康酸、a-丁酮酸的微生物產生了抑制。根際的酸類碳源利用主要由D-半乳糖醛酸及D-葡萄胺酸貢獻，而這2類碳源在非根際基本沒有利用，說明根際有促進該2類羧酸為碳源的微生物生長的作用。

非根際沉積物對苯乙基胺的利用程度最高，而可利用苯乙基胺的微生物在菖蒲根際受到了抑制。根際及非根際對腐胺的利用程度相當，利用程度較低;根際沉積物的胺類利用程度明顯高于非根際主要是由 N-乙?；?D-葡萄胺引起的，其在根際的AWCD達到1.0，而在非根際卻沒有利用。胺類碳源利用結果說明苯乙基胺及N-乙酰基-D-葡萄胺是造成非根際及根際沉積物利用胺類差異的主要原因。

非根際與根際沉積物微生物對于酯類碳源的利用程度及規(guī)律相似，即吐溫80＞吐溫40＞丙酮酸甲酯，二者對D-半乳糖內酯基本不利用，這說明可利用D-半乳糖內酯的微生物在根際及非根際均受到抑制。

非根際沉積物對醇類碳源基本不利用，而菖蒲根際對I-赤藻糖醇不利用，對D-甘露醇及D，L-a-甘油的利用程度明顯增強，說明菖蒲根際中能利用D-甘露醇及D，L-a-甘油的微生物增加或者是活性明顯增強，醇類總效應中根際與非根際的差異主要由D-甘露醇及D，L-a-甘油的利用引起。

圖4 菖蒲根際沉積物微生物對31種碳源的利用情況Fig.4 Relative use efficiency of 31 carbon sources by microbial community in rhizosphere sediment of Acorus calamus L.

3.4 沉積物微生物多樣性指數(shù)比較分析

沉積物微生物群落利用碳源類型的多少可用多樣性指數(shù)表示［25］，不同的微生物多樣性指數(shù)反映了沉積物微生物群落功能多樣性的不同側面。Shannon指數(shù)用于評價群落的豐富度，從表2可以看出，菖蒲的根際環(huán)境中存在較為豐富的微生物群落種類，該指標與豐富度指數(shù)是相一致的。豐富度指數(shù)S則可直觀地體現(xiàn)微生物群落種類的多少，根際沉積物中的微生物種類顯著高于非根際;Simpson指數(shù)反映群落中某些常見種的優(yōu)勢度，根際及非根際沉積物的微生物優(yōu)勢度指數(shù)差異不大，這可能和二者中都存在以酯類為主要碳源的微生物類群有關系。Pielou指數(shù)是群落物種均一性的度量，菖蒲的根際改變了沉積物中微生物的群落結構從而使得均一性較好。從總體上看，根際沉積物微生物功能多樣性處于較高水平，這些指數(shù)的大小總體上與2種不同沉積物AWCD是相一致的。

表2 根際及非根際沉積物微生物功能多樣性指數(shù)Table 2 Functional diversity indices of microbial communities in non-rhizosphere sediment and rhizosphere sediment

4 結論

(1)水生植物菖蒲的種植可顯著提高沉積物中微生物的總活性，相比于未種植植物的沉積物，120 h內AWCD的變化速度和最終AWCD值均有較大程度的提高。

(2)糖類、氨基酸類、酸類、醇類、胺類及酯類這6大類碳源中，非根際沉積物微生物對酯類碳源的利用程度最高，其次是胺類，對氨基酸類及羧酸類的利用程度較低，對糖類及醇類利用程度最低;菖蒲根際沉積物微生物對酯類及糖類的利用程度最高，其次是氨基酸類及醇類，對胺類及羧酸類的利用程度最低。

(3)根際及非根際微生物利用的氨基酸類、酸類、醇類、胺類及酯類碳源的總效應由不同的碳源造成，菖蒲根際改變了沉積物原有的微生物群落結構。

(4)菖蒲的種植可顯著增加沉積物微生物多樣性，表征微生物多樣性的Shannon-Wiener指數(shù)、豐富度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)均要顯著高于非根際沉積物。

［1］SMALLA K，SESSITSCH A，HARTMANN A.The Rhizosphere:Soil Compartment Influenced by the Root［J］.FEMSMicrobiology Ecology，2006，56(2):165.

［2］WALTER W W.Rhizosphere Processes and Management in Plant-assisted Bioremediation(phytoremediation)of Soils［J］.Plant and Soil，2009，321(1/2):385－408.

［3］ABDUL G K.Role of Soil Microbes in the Rhizospheres of Plants Growing on Trace Metal Contaminated Soils in Phytoremediation［J］.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，2005，18(4):355－364.

［4］SICILIANOSD，GERMIDA JJ.Mechanisms of Phytoremediation:Biochemical and Ecological Interactions Between Plants and Bacteria［J］.Environmental Reviews，1998，6(1):65－79.

［5］羅永清，趙學勇，李美霞.植物根系分泌物生態(tài)效應及其影響因素研究綜述［J］.應用生態(tài)學報，2012，23(12):3496－3504.(LUO Yong-qing，ZHAO Xueyong，LI Mei-xia.Ecological Effect of Plant Root Exudates and Related Affecting Factors:A Review［J］.Journal of Applied Ecology，2012，23(12):3496－ 3504.(in Chinese))

［6］ALKORTA I，GARBISU C.Phytoremediation of Organic Contaminants in Soils［J］.Bioresource Technology，2001，79(3):273－276.

［7］PILON-SMITS E.Phytoremediation［J］.Annual Review of Plant Biology，2005，56:15－39.

［8］JOHNSON D L，ANDERSON D R，MCGRATH SP.Soil Microbial Response During the Phytoremediation of a PAH Contaminated Soil［J］.Soil Biology and Biochemistry，2005，37(12):2334－2336.

［9］KAREN E G，HUANG X D，BERNAERD R G，et al.Phytoremediation and Rhizoremediation of Organic Soil Contaminants:Potential and Challenges［J］.Plant Science，2009，176(1):20－30.

［10］YAOH Y ，XU JM，HUANG CY.Substrate Utilization Pattern，Biomass and Activity of Microbial Communities in a Sequence of Heavy Metal-polluted Paddy Soils［J］.Geoderma，2003，115(1):139－148.

［11］XIE H J，SHI Y J，ZHANG J，et al.Degradation of Phthalate Esters(PAEs)in Soil and the Effects of PAEs on Soil Microcosm Activity［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2010，85(8):1108－1116.

［12］KELA P W，MATTHIAS G，RAYMOND L L.Assessment of Changes in the Microbial Community of Constructed Wetland Mesocosms in Response to Acid Mine Drainage Exposure［J］.Water Research，2008，42(1):180－188.

［13］ZHAO L Y，ZHU C，GAO CX，et al.Phytoremediation of Pentachlorophenol-contaminated Sediments by Aquatic Macrophytes［J］.Environmental Earth Sciences，2011，64(2):581－588.

［14］KEUN H C，F(xiàn)RED CD.Comparison of Two Kinds of Biolog Microplates(GN and ECO)in Their Ability to Distinguish Among Aquatic Microbial Communities［J］.Journal of Microbiological Methods，1999，36(3):203－213.

［15］郝曉暉，胡榮桂，吳金水，等.長期施肥對稻田土壤有機氮，微生物生物量及功能多樣性的影響［J］.應用生態(tài)學報，2010，21(6):1477－1484.(HAO Xiaohui，HU Rong-gui，WU Jin-shui，et al.Effects of Longterm Fertilization on Paddy Soils Organic Nitrogen，Microbial Biomass，and Microbial Functional Diversity［J］.Journal of Applied Ecology，2010，21(6):1477－1484.(in Chinese))

［16］彭芳芳，羅學剛，王麗超，等.鈾尾礦周邊污染土壤微生物群落結構與功能研究［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2013，32(11):2192－2198.(PENG Fang-fang，LUO Xue-gang，WANG Li-chao，et al.Microbial Community Structure and Function in Soils Around Uranium Tailings［J］.Journal of Agro-environment Science，2013，32(11):2192－2198.(in Chinese))

［17］XIE Wen-jun，ZHOU Jian-min，WANG Huo-yan，et al.Short-term Effects of Copper，Cadmium and Cypermethrin on Dehydrogenase Activity and Microbial Functional Diversity in Soils after Long-term Mineral or Organic Fertilization［J］.Agriculture，Ecosystems ＆ Environment，2009，129(4):450－456.

［18］WU Xiao-qin，YUAN Wei-min，TIAN Xiao-jing，et al.Specific and Functional Diversity of Endophytic Bacteria from Pine Wood Nematode Bursaphelenchus xylophilus with Different Virulence［J］.International Journal of Biological Sciences，2013，9(1):34－44.

［19］HUA F，HAN Y L，YIN Y M，et al.Microbial Response to Repeated Treatments of Manure Containing Sulfadiazine and Chlortetracycline in Soil［J］.Journal of Environmental Science and Health，Part B，2014，49(8):609－615.

［20］白愛芹，傅伯杰，曲來葉，等.重度火燒跡地微地形對土壤微生物特性的影響－－以坡度和坡向為例［J］.生態(tài)學報，2013，33(17):5201－5209.(BAI Ai-qin，F(xiàn)U Bo-jie，QU Lai-ye，et al.The Study of Characteristics of Soil Microbial Communities at High Severity Burned Forest Sites for the Great Xingan Mountains:An Example of Slope and Aspect［J］.Acta Ecologica Sinica，2013，33(17):5201－5209.(in Chinese))

［21］WANG Xiang，WANG Qun-hui，WANG Shi-jie，et al.Effect of Biostimulation on Community Level Physiological Profiles of Microorganisms in Field-scale Biopiles Composed of Aged Oil Sludge［J］.Bioresource Technology，2012，111:308－315.

［22］羅 倩，黃寶靈，唐治喜，等.新疆鹽漬土3種植被類型土壤微生物碳源利用［J］.應用與環(huán)境生物學報，2013，19(1):96－ 104.(LUO Qian，HUANG Baoling，TANG Zhi-xi，et al.Carbon Source Utilization of Microbes in Saline Soil of Three Vegetation Types in Xinjiang，China［J］.Chinese Journal of Applied＆ Environmental Biology，2013，19(1):96－104.(in Chinese))

［23］JAY L G，AARON L M.Classification and Characterization of Heterotrophic Microbial Communities on the Basis of Patterns of Community-level Sole-carbon-source Utilization［J］. Applied and Environmental Microbiology，1991，57(8):2351－2359.

［24］倪才英，曾 珩，黃玉源，等.紫云英根際微生物碳源利用多樣性研究［J］.廣西植物，2009，29(5):614－620.(NI Cai-ying，ZENG Heng，HUANG Yu-yuan，et al.Functional Diversity of Microbial Community in Bulk and Rhizosphere Soil of Astragalus sinicus［J］.Guihaia，2009，29(5):614－620.(in Chinese))

［25］李志斐，謝 駿，郁二蒙，等.基于 Biolog-ECO技術分析雜交鱧和大口黑鱸高產池塘水體微生物碳代謝特征［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2014，33(1):185－192.(LI Zhi-pei，XIE Jun，YUN Er-meng，et al.Carbon Metabolic Diversity of Microbial Communities in Intensive Ponds for Hybrid Snakehead and Largemouth Bass Based on Biolog-ECO Plates［J］.Journal of Agro-environment Science，2014，33(1):185－192.(in Chinese ))