胡萬銀

摘 ? ?要：本試驗以報春花葉片、莖段作為外植體，進行了初代組織培養(yǎng)，并進行增殖、生根培養(yǎng)。結果表明：75%的酒精（0.5 min）+0.1%升汞（8 min）具有很好的消毒作用;MS +6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1是不定芽分化的最佳培養(yǎng)基配比;MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1是不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基配比;1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1是生根的最佳培養(yǎng)基配比。

關鍵詞：報春花;外植體;培養(yǎng)基

中圖分類號：S688 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.036

Tissue Culture of Primula malacoides Franch.

HU Wan-yin

（Tree Breeding Research Center of Shanxi Province，Taiyuan， Shanxi 030006 ， China）

Abstract： In this experiment， leaves and stems of Primula malacoides Franch. were taken as explants， and conducted the primary tissue culture， and proliferation， rooting culture. The results showed that 75% alcohol （0.5 min） 0.1% mercuric chloride （8 min） had good disinfection effect; the best medium ratio for the differentiation of adventitious buds was MS +6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1; for adventitious bud proliferation， the optimum culture medium composition was MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +NAA 0.2 mg·L-1; 1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1 was the best rooting culture medium composition.

Key words： Primula malacoides Franch.; explants; callus culture medium

報春花 （Primula malacoides Franch.）又名小種櫻草、七重樓，報春花科報春花屬，葉片長卵形或圓形，葉緣有齒，葉柄長5 cm左右?；ㄝ愀?0～30 cm，花冠高腳碟狀。多生長于荒野、田邊，原產于中國的云南、貴州，各地栽培，頗具觀賞性。

報春花原產中國，草本植物。喜氣候溫涼、濕潤的環(huán)境和排水良好、富含腐殖質的土壤，不耐高溫和強烈的直射陽光，多數亦不耐嚴寒。葉基生，全株被白色絨毛?；ㄍǔ?型，排成傘形花序或頭狀花序?；ㄆ跒?2月至次年4月，早春開花為本屬植物的重要特性，其中文名報春和學名均含有早花的意思。近年來發(fā)展很快，已成為當前一類重要的園林花卉。

組織培養(yǎng)又叫離體培養(yǎng)，通常指從植物體中分離出符合需求的組織（器官、細胞、原生質體等），在人工無菌操作條件下，進行培養(yǎng)從而獲得再生的完整植株，或者生產出具有經濟價值的其他產品的技術。本試驗以報春花葉片、莖段為外植體，進行了初代組織培養(yǎng)，并進行增殖、生根培養(yǎng)，在建立報春花組織培養(yǎng)無菌體系的基礎上，對比了外植體不同滅菌方法對滅菌效果的影響，以及不同激素濃度對報春花葉片、莖段芽分化、不定芽增殖及其生根的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

使用材料取自盆栽報春花的葉片和莖段。

1.2 試驗材料的處理

組織培養(yǎng)前，先從室內培養(yǎng)的盆栽植株上取生長旺盛的報春花葉片和嫩莖作外植體，取材后放入燒杯里，用大量的水洗去表面附著物后，再放到自來水管下進行二次沖洗（時間約60 min），然后放入到瓶中，在超凈工作臺上再迅速用無菌蒸餾水沖洗3遍后等分為2份。每種消毒劑處理15瓶，每瓶接種4塊，處理方法見表1。最后，用無菌蒸餾水沖洗6次。將葉片橫切和縱切后切成1 cm×1 cm大小，將嫩莖切成1 cm左右的莖段作外植體用。

1.3 培養(yǎng)基配比

基本培養(yǎng)基為MS，瓊脂為6 g，蔗糖濃度為3%，pH 值為5.8。初代培養(yǎng)基為：（1）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（2）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;（3）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（4）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1;（5）MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（6）MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。增殖培養(yǎng)基為：（7）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1;（8）MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。生根培養(yǎng)基為：（9）1/2MS+NAA ?0.1 mg·L-1;（10）1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1。培養(yǎng)室內溫度為（25±2） ℃，光照強度1 500～2 000 lx，每天光照12 h，補光燈在光照不夠的條件下及時補光。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑處理的消毒效果

進行初代培養(yǎng)10 d后對120瓶培養(yǎng)情況進行統計，結果見表2。處理Ⅰ、處理Ⅱ的消毒效果差異明顯，處理Ⅱ的消毒效果是處理Ⅰ的17倍，因此單獨使用酒精對報春花外植體進行消毒處理，污染率高，效果不太好;而用70%酒精（0.6 min）+0.1%HgCl2（10 min）對報春花外植體消毒效果明顯。

2.2 不同外植體誘導愈傷組織的時間

經過初代培養(yǎng)10 d后，對每種培養(yǎng)基中莖段和葉片愈傷組織形成情況進行統計，從表3可看出，由于培養(yǎng)基配比不同，如果培養(yǎng)基配比合適，報春花葉片在第11天就可以形成愈傷組織，而莖段需要在第15天左右才能形成，其誘導時間比用葉片作為外植體的時間要長約4 d左右。

2.3 激素對初代培養(yǎng)的影響

將經過消毒組合Ⅱ處理好的外植體接種到初代培養(yǎng)基1～6，培養(yǎng)11 d后，大部分葉片的切塊邊緣首先開始膨大，長出淡綠色的愈傷組織，并呈疏松的顆粒狀，有部分葉片在切口處直接產生不定芽;接種20 d后愈傷組織表面出現綠色芽點，開始分化出0.2～0.5 cm的不定芽，35 d后頂芽萌動并長出側芽和分枝。

表4是第36天出芽的外植體統計數，激素的影響由表4中可以看出。在培養(yǎng)過程中還發(fā)現，當6-BA 2.0 mg·L-1、NAA0.1 mg·L-1時，在后期出現部分芽苗玻璃化、失綠現象;當NAA 0.2 mg·L-1、6-BA 2.0 mg·L-1時，分化出的不定芽形態(tài)明顯弱小;當6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1時，誘導率較高，而且芽苗生長健壯，芽苗利用率也好。因此，初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基配比為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

2.4 激素對增殖培養(yǎng)的影響

將初代培養(yǎng)得到的芽叢和分枝切割成帶1～2個節(jié)的小段，轉接到培養(yǎng)基7～8上，約15 d后，就可以不斷長出大量的芽和分枝，培養(yǎng)基7和8中的芽都有增殖，但是培養(yǎng)基配比8的效果好，分化叢生芽芽體健壯，數量多，長勢良好，適合葉、莖段的繼代培養(yǎng)。當NAA為0.1 mg·L-1時，有部分芽生長良好，但部分芽體長勢較略差，長不高，影響叢生芽的大量繼代增殖（表5）。

2.5 激素對生根培養(yǎng)的影響

切取分化增殖所得到的高約2～3 cm生長健壯的叢生芽苗，將分枝切成帶有2個節(jié)的莖段，轉接種到添加不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基9～10中。在生根培養(yǎng)進行到第30天的時候，對叢生芽的生根情況進行了統計，結果見表6。

當在1/2MS基本培養(yǎng)基中添加NAA濃度為0.1 mg·L-1（培養(yǎng)基9）時，生根率為85.0%，平均生根數達到12.6條，根長為1. 0 cm左右。當添加NAA濃度為0.2 mg·L-1（培養(yǎng)基10）后，誘導的叢生芽生根率升高，達到97.5%，平均生根數有13.8條左右，并且根粗壯，苗長勢良好，根長為1.4 cm左右。

3 結論與討論

由于報春花葉片肉質光滑，易于表面滅菌消毒，無菌操作簡單，切割過程也容易操作，瓶苗移栽后管理較粗放，組培繁殖極易見效率，經濟效益亦是可觀的。

因為植物體表面常附有各種各樣的微生物，無菌操作過程中，對于植物材料表面的消毒尤為重要，因為一旦帶進培養(yǎng)基，微生物就會迅速滋生造成植物材料死亡。75%酒精（0.5 min）+0.1%HgCl2（8 min）的消毒處理有更強的殺菌能力和穿透力，而且有濕潤作用，對報春花葉片和莖段的消毒處理效果明顯。

植物激素的種類和配比，是使植物組織分化出苗和快速增殖的重要因素，通過此次不同梯度培養(yǎng)基配比，發(fā)現雖然都能使植物分化出苗和增殖，但是低濃度和高濃度的激素配比使植物分化出苗較慢，同時細胞分裂素和生長素比例過高，導致玻璃化苗的產生，其中MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1激素配比最佳，利于報春花愈傷組織的生長和分化，進行初代培養(yǎng);MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1是最有利于增殖的培養(yǎng)基;最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1。

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