龐有志 吳勝軍 趙淑娟 白俊艷 張小輝 贠銀現(xiàn) 祁艷霞（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 471003）

蛋用黑羽鵪鶉微衛(wèi)星多態(tài)性分析

龐有志 吳勝軍 趙淑娟 白俊艷 張小輝 贠銀現(xiàn) 祁艷霞（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 471003）

對(duì)蛋用黑羽鵪鶉群體9個(gè)微衛(wèi)星座位的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在為黑羽鵪鶉遺傳資源的評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用提供新的依據(jù)。結(jié)果表明，9個(gè)微衛(wèi)星座位共檢測(cè)出46個(gè)等位基因，平均每個(gè)座位檢測(cè)到5.1111個(gè)。平均雜合度為0.6952，平均多態(tài)信息含量為0.6204，表明蛋用黑羽鵪鶉是遺傳多樣性較豐富的群體。其中有8個(gè)微衛(wèi)星可以作為黑羽鵪鶉群體的有效遺傳標(biāo)記進(jìn)行群體遺傳多樣性分析。χ2檢驗(yàn)表明，9個(gè)微衛(wèi)星座位的基因分布均極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）。

黑羽鵪鶉；微衛(wèi)星；羽色突變；不完全隱性突變；遺傳多樣性；試驗(yàn)

蛋用黑羽鵪鶉是本課題組最新發(fā)現(xiàn)的一種羽色突變，它是來(lái)自蛋用中國(guó)黃羽鵪鶉與朝鮮鵪鶉配套系的雜種，經(jīng)分離、純化培育而來(lái)。雜交驗(yàn)證初步證實(shí)，該羽色突變是由常染色體發(fā)生不完全隱性突變的結(jié)果?？刂坪谟鹦誀畹幕騢位于常染色體上，相對(duì)于等位基因H為不完全隱性，該基因座與性染色體Z上的基因座B/b和Y/y具有一定的互作關(guān)系[1]。目前關(guān)于鵪鶉的微衛(wèi)星多態(tài)性研究并不多，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)王惠影等[2]、常國(guó)斌等[3]、Olowofeso等[4]對(duì)野生鵪鶉微衛(wèi)星的研究以及孟慶美等[5]、吳勝軍等[6]對(duì)朝鮮鵪鶉研究的相關(guān)報(bào)道。本研究利用9個(gè)具有豐富多態(tài)信息含量的微衛(wèi)星DNA，對(duì)新培育的蛋用黑羽鵪鶉進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，旨在探討蛋用黑羽鵪鶉的遺傳多態(tài)性，為我國(guó)鵪鶉的遺傳資源的評(píng)價(jià)、保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗(yàn)鵪鶉來(lái)自河南科技大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)，隨機(jī)抽取蛋用黑羽鵪鶉100只，公母各半。每只心臟采血2ml，血樣采用ACD抗凝，血液：ACD為6:1。-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 引物的選擇及合成

從Kayang等[7]建立的鵪鶉微衛(wèi)星連鎖圖譜中篩選多態(tài)性比較高的基因座，確定了9對(duì)微衛(wèi)星基因座作為本次研究的遺傳標(biāo)記。引物序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。微衛(wèi)星座位相關(guān)資料見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)選用9個(gè)微衛(wèi)星基因座的相關(guān)資料

1.2 方法

1.2.1 PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系總體積為12.5μl，其中ddH2O8.65μl，10×Buffer1.25μl， Mg2+（25mmol/L） 0.75μl， DNA 模 板0.5μl，上、 下游引物各 0.5μl（10mmol/L）， dNTPs0.25μl， Taq 酶0.1μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，X℃退火 60s，72℃延伸 60s，30次循環(huán)；最后 72℃延伸12min，4℃保存。退火溫度具體見(jiàn)表1。

表29 個(gè)微衛(wèi)星的等位基因大小和頻率

1.2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及聚丙烯酰胺凝膠電泳

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0×TBE的電泳緩沖液配制成的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3μl和等體積的上樣緩沖液混合點(diǎn)樣，電泳，并以DNAmarker作對(duì)照，在紫外透射分析儀上觀察是否有所需的條帶，若特異性條帶明亮而且雜帶很少，便可轉(zhuǎn)到8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。120V電泳2h左右，硝酸銀染色后用成像儀拍照保存并分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)pBR322DNA/MspⅠMarker，檢測(cè)等位基因片段大小，確定全部個(gè)體在各微衛(wèi)星座位的基因型。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)分子生物軟件POPGENE（Version1.32）分析每個(gè)基因座的多態(tài)信息含量（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）、雜合度（H）。對(duì)各基因座的基因型分布按照Hardy-Weinerg平衡定律進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星座位聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

9個(gè)微衛(wèi)星座位在蛋用黑羽鵪鶉群體中都具有明顯的多態(tài)性，其中微衛(wèi)星座位GUJ0023和GUJ0028電泳圖結(jié)果詳見(jiàn)圖1和圖2?？梢钥闯鑫⑿l(wèi)星座位GUJ0023和GUJ0028具有豐富的多態(tài)性。

圖1 微衛(wèi)星座位GUJ0023的PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 微衛(wèi)星座位GUJ0028的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 微衛(wèi)星等位基因及其頻率

由表2可見(jiàn)，9個(gè)微衛(wèi)星座位在蛋用黑羽鵪鶉群體中共檢測(cè)到46個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為5.1111。其中GUJ0023、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0077在蛋用黑羽鵪鶉群體中均檢測(cè)到6個(gè)等位基因，基因片段分別為：219～244bp、147～175bp、 145～170bp、 260～285bp。 GUJ0028、 GUJ0097、GUJ0059在蛋用黑羽鵪鶉群體中均檢測(cè)到5個(gè)等位基因，基因片段分別為： 160～185bp、 130～170bp、 230～246bp。GUJ083和GUJ0063在蛋用黑羽鵪鶉群體中分別檢測(cè)到4和3個(gè)等位基因，基因片段分別為：130～155bp、242～246bp。

微衛(wèi)星位點(diǎn) GUJ0097、 GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、GUJ0059、GUJ0057、GUJ0029、GUJ0028和GUJ0023在黑羽鵪鶉群體中分別有17、9、15、3、11、12、19、14和16種基因型。除了GUJ0028有兩種優(yōu)勢(shì)基因（160bp、180bp）外，其他微衛(wèi)星位點(diǎn)均只有一種優(yōu)勢(shì)基因。GUJ0097、GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、 GUJ0059、 GUJ0057、GUJ0029、GUJ0023優(yōu)勢(shì)基因分別為：147bp、147bp、260bp、 244bp、 246bp、 162bp、 160bp、 240bp。 GUJ0097、GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、 GUJ0059、 GUJ0057、GUJ0029、GUJ0028、GUJ0023的優(yōu)勢(shì)基因型分別為：147/147、 155/147、 270/260、 244/244、 246/246、 162/162、 160/160、180/160、240/240。對(duì) 9個(gè)微衛(wèi)星座位進(jìn)行 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，各基因座位均極顯著偏離遺傳平衡（P＜0.01）。

2.3 微衛(wèi)星座位的基因雜合度和多態(tài)信息含量

由表3可以看出，在黑羽鵪鶉群體中微衛(wèi)星位點(diǎn)GUJ0077具有最高的多態(tài)信息含量為0.7392，GUJ0028具有最高的雜合度為0.7852，同時(shí)GUJ0028也具有最高的有效等位基因數(shù)為4.6555。9個(gè)微衛(wèi)星在黑羽鵪鶉群體中平均多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、雜合度分別為0.6204、3.5338和0.6952。

表3 9個(gè)微衛(wèi)星等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、雜合度

3 討論

有效等位基因數(shù)是純合度的倒數(shù)，反映了微衛(wèi)星位點(diǎn)上所有等位基因之間的相互影響程度。有效等位基因數(shù)越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻。本研究的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、 GUJ0057、 GUJ0059、 GUJ0063、 GUJ0077、GUJ0083和GUJ0097在鵪鶉總?cè)后w中有效等位基因分別為3.8760、 4.6555、 3.7258、 3.0544、 3.2755、 1.8574、 4.4504、2.7255和4.1841，9個(gè)微衛(wèi)星座位的等位基因在群體中分布不均勻。

多態(tài)信息含量（PIC）是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，表明該基因座為高度多態(tài)基因座；0.25＜PIC＜0.5時(shí)表明該基因座為中度多態(tài)基因座，PIC＜0.25時(shí)表明該基因座為低度多態(tài)基因座[8]。本研究所選的9個(gè)微衛(wèi)星座位，除了GUJ0063在黑羽鵪鶉群體中為中度多態(tài)性座位外，其余8個(gè)微衛(wèi)星座位均為高度多態(tài)座位，表明這8個(gè)高度多態(tài)基因座位可以作為黑羽鵪鶉群體的有效遺傳標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析。

本研究在蛋用黑羽鵪鶉群體9個(gè)微衛(wèi)星座位中共檢測(cè)到46個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為5.1111，最低為3個(gè)，最高為6個(gè)，表明這些微衛(wèi)星座位具有較高的多態(tài)性。遺傳雜合度表示在微衛(wèi)星座位上雜合子個(gè)體占畜禽群體的比例，它反映微衛(wèi)星座位在畜禽群體中的遺傳變異程度，一般認(rèn)為它是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)。平均雜合度的大小可以近似地反映出遺傳變異程度的高低，雜合度越高，表明群體內(nèi)遺傳多樣性就越高，遺傳變異程度就越大，反之則群體內(nèi)遺傳變異程度就小。孟慶美等[5]研究了朝鮮鵪鶉群體12個(gè)微衛(wèi)星的平均雜合度為0.7111，吳勝軍等[6]研究了朝鮮鵪鶉群體9個(gè)微衛(wèi)星平均雜合度為0.7096。Farrag等[9]利用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在伊朗的4個(gè)日本鵪鶉品系中的平均雜合度為0.6090。Hossein等[10]研究表明日本鵪鶉Pharach品系12個(gè)微衛(wèi)星的平均雜合度為0.3873。而本研究的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在黑羽鵪鶉群體中平均雜合度為0.6952，可以看出，新選育的黑羽鵪鶉群體的遺傳多樣性略低于朝鮮鵪鶉，而高于日本鵪鶉。這為蛋用黑羽鵪鶉的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供了重要依據(jù)。

χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，本研究測(cè)定的9個(gè)微衛(wèi)星座位在黑羽鵪鶉群體中均極顯著偏離遺傳平衡（P＜0.01）。遺傳平衡與否與檢測(cè)樣本含量有一定關(guān)系，樣本不夠大時(shí)，有些基因座就可能檢測(cè)不到全部的等位基因。Baker[11]指出，在檢測(cè)每個(gè)品種時(shí)應(yīng)分析25個(gè)樣本數(shù)，為了避免出現(xiàn)誤差樣本數(shù)應(yīng)達(dá)到50個(gè)。就本研究而言，樣本含量（100）已經(jīng)達(dá)到抽樣的要求，表明遺傳不平衡不是樣本的原因，很可能是黑羽鵪鶉群體受到過(guò)度人工選擇或近親繁殖等因素的影響，這與近年來(lái)對(duì)黑羽鵪鶉進(jìn)行小群體保種可能有關(guān)。

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河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（082102130002）；河南科技大學(xué)校基金項(xiàng)目（2008ZY016）。

龐有志（1963.4-），男，河南省新蔡縣人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。