宋亞芹，付文博，盧 沐，劉 洋，魏育濤

0 引 言

微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能夠識別特定的mRNA，并在轉(zhuǎn)錄后水平通過促進(jìn)mRNA的降解或抑制翻譯過程而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用［1］。miRNA在物種進(jìn)化中具有高度保守性、時序性和組織特異性，其決定組織和細(xì)胞的功能特異性，在細(xì)胞生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)中起多種作用［2-3］。對miRNA的早期研究認(rèn)為，絕大多數(shù)人類miRNA基因都不成簇存在于基因組內(nèi)［1］，然而 Altuvia 等［4］通過對 miRNAs基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，約37%的已知人類基因是成簇存在的［4］，這些基因簇在不同物種間具有較高的保守性，然而它們的生物學(xué)意義尚不完全清楚，不過已有實驗證實，一些miRNA基因簇在功能上比單個miRNA的作用更高效，多個成員同時作用能更加有效地行使其功能，保證生命活動正常有序地進(jìn)行［5］。因此，對miRNA基因簇進(jìn)行相關(guān)研究，有利于深入了解其復(fù)雜的調(diào)控功能。

MiR-106b-25簇涉及腫瘤的增殖凋亡等生物學(xué)過程，其成員包括 miR-106b、miR-93和 miR-25，位于人類第7號染色體MCM-7基因的第13內(nèi)含子處［6］，雖然miR-106b-25簇以多順反子的形式被轉(zhuǎn)錄，但由于其種子序列不同，miR-106b-25簇分屬于2個不同的家族:miR-17家族和miR-25家族，前者種子序列為AAAGG，成員包括 miR-106b和 miR-93;后者種子序列為 AUUGCA，成員包括 miR-25?？蒲卸嘁詍iR-106b、miR-93及miR-25中一個為研究對象，鮮有以其三者同時作為目標(biāo)研究相關(guān)性。生物信息學(xué)是處理大量生物信息的新的研究手段，運用生物學(xué)、數(shù)學(xué)和計算機(jī)知識，利用多種數(shù)據(jù)庫，研究和分析生命體各種信息，近年來，生物信息學(xué)飛速發(fā)展，應(yīng)用其發(fā)現(xiàn)新基因并進(jìn)行功能研究成為熱點［7］。本研究旨在通過生物信息學(xué)的方法探索該基因簇所有成員的生物學(xué)功能，并進(jìn)一步分析其家族成員在調(diào)控生物學(xué)過程中的相互作用，為后續(xù)的實驗研究提供線索與思路。

1 材料與方法

運用在線靶基因預(yù)測軟件TargetScan6.1(http://www.targetscan.org/)，PicTar(http:pictar.mdc-berlin.de/)和 miRanda(http://www.microrna.org/)分別預(yù)測miR-106b、miR-93和miR-25的靶基因，分別取三者的交集，然后利用miRTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.php)數(shù)據(jù)庫分別尋找這3個miRNA經(jīng)3種及3種以上實驗驗證過的靶基因，所得結(jié)果與前面的交集組成下一步分析的基因集合。分別將3個基因集合使用GeneOntology(http://geneontology.org/)［8-9］和 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)［10-11］數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物過程的功能富集分析和基于KEGG數(shù)據(jù)庫的信號通路富集分析，即得到基因集合在富集分析類別上的高頻率注釋以及有統(tǒng)計學(xué)意義的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和疾病通路。之后將3個基因集合匯總導(dǎo)入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)［12-13］，得到 3個miRNA靶基因編碼蛋白間的相互作用圖(PPI)。

GeneOntology進(jìn)行功能富集分析用到Fisher精確檢驗和χ2檢驗，通過多重比較檢驗，確定功能富集的誤判率(false discovery rate，F(xiàn)DR)，完成功能富集分析。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析是對基因參與的所有信號通路進(jìn)行顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分析，用到的分析方法同功能富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-106b-25簇的靶基因預(yù)測 TargetScan、PicTar及miRanda預(yù)測miR-106b的靶基因得到交集6個，結(jié)合miRTarbase中實驗驗證的靶基因8個，得到靶基因集合14個;同法預(yù)測miR-93得到交集17個，實驗驗證8個，得到靶基因集合25個;預(yù)測miR-25得到交集28個，實驗驗證16個，得到靶基因集合54 個，見表1。雖然TargetScan、PicTar、miRanda的預(yù)測方法不同，但均以保證miRNA與相應(yīng)靶基因的序列保守性為基礎(chǔ)，故所得交集靶基因與相應(yīng)miRNA結(jié)合具有較高的保守性。

表1 miR-106b-25簇的預(yù)測靶基因Table 1 Predicted target genes of the miR-106b-25 cluster

2.2 miR-106b-25簇的生物過程富集分析及KEGG通路分析 分別將miR-106b、miR-93、miR-25 3個基因集合作為靶基因集合通過GeneOntology(http://geneontology.org/)和 DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物過程富集分析和基于KEGG數(shù)據(jù)庫的信號通路富集分析，結(jié)果顯示3個miRNA的生物過程集中富集于:新陳代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖及投射等生物學(xué)過程，見表2。

表2 miR-106b-25簇的生物學(xué)過程富集分析Table 2 Biological process enrichment of the miR-106b-25 cluster

三者的pathway通路富集分析明顯集中于:膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺癌等腫瘤相關(guān)通路上，見表3。

2.3 靶基因編碼蛋白間的相互作用 將三者的靶基因集合匯總后通過STRING在線分析軟件(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，http://www.String-db.Org/)分析靶基因編碼蛋白間的相互作用并做出蛋白互作圖，見圖1。圖中顯示miR-106b-25簇3個成員靶基因編碼蛋白間具有復(fù)雜的相互作用，尤其是靶基因KAT2B、PTEN、TP53、CDH1、MDM2、E2F1、RB1、SMAD7 編碼蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)中起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，而它們分屬于miR-106b-25簇的3個成員。

圖1 miR-106b-25簇的靶基因編碼蛋白互作圖Figure 1 Protein-protein interaction network of the miR-106b-25 cluster

3 討 論

有研究指出，對不同腫瘤中的miR-106b-25基因簇進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞發(fā)展周期明顯減慢，3個成員的表達(dá)效果雖然不同，但是趨勢相同，表明該基因簇的成員在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中起到一定作用［14］。我們的研究結(jié)果顯示，miR-106b-25簇3個成員靶基因集合的生物學(xué)過程明顯富集于細(xì)胞代謝過程及細(xì)胞分裂周期，而另有研究表明miR-106b-25簇參與了細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換，這一功能主要涉及RB通路［15］，在一些有關(guān)胃癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-93、miR-106b和miR-25通過調(diào)控細(xì)胞周期而影響細(xì)胞生長［16］，揭示了位于同一簇的miRNA在功能上的相關(guān)性。目前為止關(guān)于miR-93及miR-106b與細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換關(guān)系已有相關(guān)研究:miR-93可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞周期的 G1/S期轉(zhuǎn)換［17］;miR-106b可以提高E2F轉(zhuǎn)錄因子的活性來促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，同時也促進(jìn)細(xì)胞增殖［18］。但有關(guān)miR-25與腫瘤細(xì)胞周期的研究還很少，這為下一步的課題提供了研究思路。既然miR-106b-25簇的成員間具有較強(qiáng)的功能相關(guān)性，我們猜測miR-25也參與促進(jìn)細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)換。

KEGG通路富集分析顯示miR-106b-25基因簇靶基因集中于各種腫瘤通路中，其成員編碼的下游靶蛋白中，處于核心位置的有E2F1、PTEN、SMAD7、CDH1、KAT2B、TP53、MDM2 及 RB1。而前 4 種蛋白與miR-106b-25基因簇的關(guān)系研究已有相關(guān)報道:miR-106b-25基因簇對腫瘤細(xì)胞的作用可能主要通過轉(zhuǎn)化生長因子β而發(fā)揮，而在它們之間存在一個重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F1，其對于兩者之間的關(guān)聯(lián)以及腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展具有很大影響［19-20］，同時E2F1上調(diào)還會促進(jìn)細(xì)胞周期中G1/S期的轉(zhuǎn)化，對腫瘤細(xì)胞的周期產(chǎn)生影響［21］;PTEN作為一種腫瘤抑制因子，有抑制細(xì)胞增殖的作用，這種腫瘤抑制蛋白受到miR-106b-25簇的抑制，并且這種抑制與miR-106b-25簇的成瘤性有關(guān)［22］。有研究顯示PTEN對細(xì)胞p13k/AKT通路具有重要影響，通過調(diào)控細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式阻止腫瘤細(xì)胞的生長，然而在前列腺癌和卵巢癌中miR-93可以靶向結(jié)合PTEN，降低PTEN表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲［23-25］;Smith 等［26］在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Six1表達(dá)上調(diào)可激活miR-106b、miR-93和miR-25的表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移過程，miR-93還可通過靶向調(diào)節(jié)SMAD7基因作用于TGF-β信號通路并引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)移。CDH1是一種重要的細(xì)胞黏附分子，參與細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞遷移，在多數(shù)癌組織的細(xì)胞表面都存在CDH1的減少或消失，以致癌細(xì)胞黏附力減弱從而易從瘤塊脫落，成為侵襲與轉(zhuǎn)移的前提，Xu等［27］研究發(fā)現(xiàn)miR-25通過調(diào)控下游靶蛋白CDH1促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。上述報道中的因子與我們通過生物信息學(xué)分析預(yù)測出來的靶基因中處于核心地位的靶基因吻合，提示我們生物信息學(xué)分析的結(jié)果與后期實驗驗證的結(jié)果具有一定的一致性，但目前關(guān)于KAT2B、TP53、MDM2、RB1與miR-106b-25簇的研究還很有限，需要我們進(jìn)一步驗證。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不可能經(jīng)由單個蛋白而實現(xiàn)，通過蛋白互作圖可看出各種靶蛋白之間存在復(fù)雜的相互作用，據(jù)此可推測miR-106b-25簇中的3個成員相互作用，通過調(diào)控細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換參與腫瘤通路過程進(jìn)而調(diào)節(jié)多種下游靶蛋白促進(jìn)或是抑制腫瘤的發(fā)生，尤其是處于核心地位的 E2F1、PTEN、SMAD7、CDH1、KAT2B、TP53、MDM2 及 RB1，后5 種蛋白更是急需實驗進(jìn)行相關(guān)驗證。這一結(jié)果提高了我們針對miRNA的研究效率，不僅為預(yù)測基因提供了重要信息，還為進(jìn)一步的實驗提供了研究目標(biāo)。

［1］ Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116(2):281-297.

［2］ 龐春艷，王永福.微小RNA在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷和治療中的作用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27(5):554-556.

［3］ 楊婷婷，馬 蕾，宋守君，等.微小RNA與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27(4):431-434.

［4］ Altuvia Y，Landgraf P，Lithwick G，et al.Clustering and conservation patterns of human microRNAs［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(8):2697-2706.

［5］ Xu J，Wong C.A computational screen for mouse signaling pathways targeted by microRNA clusters［J］.RNA，2008，14(7):1276-1283.

［6］ Mendell JT.miRiad roles for the miR-17-92 cluster in development and disease［J］.Cell，2008，133(2):217-222.

［7］ 姚 楊，蘇 杰，魏 迪，等.泛素結(jié)合酶基因生物信息學(xué)與功能分析［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27(11):1156-1159.

［8］ Ashburner MB，Blake CA，Botstein D，et al.Gene ontology:tool for the unification of biology［J］.Nat Genet，2000，25(1):25-29.

［9］ Boyle EI，Weng S，Gollub J，et al.GO::TermFinder--open source software for accessing Gene Ontology information and finding significantly enriched Gene Ontology terms associated with a list of genes［J］.Bioinformatics，2004，20(18):3710-3715.

［10］ Li HL，Xie SP，Yang YL，et al.Clinical significance of upregulation of mir-196a-5p in gastric cancer and enriched KEGG pathway analysis of target genes［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2015，16(5):1781-1787.

［11］ Huang DW，Sherman BT，Tan Q，et al.DAVID Bioinformatics Resources:expanded annotation database and novel algorithms to better extract biology from large gene lists［J］.Nucleic Acids Res，2009，37(1):169-175.

［12］ von Mering C，Huynen M，Jaeggi D，et al.STRING:a database of predicted functional associations between proteins［J］.Nucleic Acids Res，2003，31(1):258-261.

［13］ Jensen LJ，Kuhn M，Stark M，et al.STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms［J］.Nucleic Acids Res，2009，37(Database issue):412-416.

［14］ Li Y，Tan W，Neo TW，et al.Role of the miR-106b-25 microRNA cluster in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Sci，2009，100(2):1234-1242.

［15］ Ohta M，Mimori K，F(xiàn)ukuyoshi Y，et al.Clinical significance of the reduced expression of G protein gamma 7(GNG7)in oesophageal cancer［J］.Br J Cancer，2008，98(7):410-417.

［16］ Petrocca F，Visone R，Onelli MR，et al.E2F1-regulated microRNAs impair TGFbeta-dependent cell-cycle arrest and apoptosis in gastric cancer［J］.Cancer Cell，2008，13(3):272-286.

［17］ 李文晰，梁琳慧，何祥火，等.Hsa-miR-93在肝癌中的作用機(jī)制研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2008，17(6):478-480，484.

［18］ Trompeter HI，Abbad H，Iwaniuk KM，et al.MicroRNAs MiR-17，MiR-20a，and MiR-106b act in concert to modulate E2F activity on cell cycle arrest during neuronal lineage differentiation of USSC［J］.PLoS One，2011，6(1):e16138.

［19］ Spender L，CInman GJ.TGF-beta induces growth arrest in Burkitt lymphoma cells via transcriptional repression of E2F-1［J］.J Biol Chem，2009，284(3):1435-1442.

［20］ Chen HZ，Tsai SY，Leone G.Emerging roles of E2Fs in cancer:an exit from cell cycle control［J］.Nat Rev Cancer，2009，9(11):785-797.

［21］ 劉 更，周鴻鷹.miR-93與腫瘤的研究進(jìn)展［J］.四川解剖學(xué)雜志，2013，21(3):28-31.

［22］ Thangavel C，Boopathi E，Ertel A，et al.Regulation of miR106b cluster through the RB pathway:mechanism and functional targets［J］.Cell Cycle，2013，12(1):98-111.

［23］ Fu X，Tian J，Zhang L，et al.Involvement of microRNA-93，a new regulator of PTEN/Akt signaling pathway，in regulation of chemotherapeutic drug cisplatin chemosensitivity in ovarian cancer cells［J］.FEBS Lett，2012，586(9):1279-1286.

［24］ Poliseno L，Salmena L，Riccardi L，et al.Identification of the miR-106b～25 microRNA cluster as a proto-oncogenic PTEN-targeting intron that cooperates with its host gene MCM7 in transformation［J］.Sci Signal，2010，3(117):ra29.

［25］ Guo J，Miao Y，Xiao B，et al.Differential expression of microRNA species in human gastric cancer versus non-tumorous tissues［J］.J Gastroenterol Hepatol，2009，24(4):652-657.

［26］ Smith AL，Iwanaga R，Drasin DJ，et al.The miR-106b-25 cluster targets Smad7，activates TGF-beta signaling，and induces EMT and tumor initiating cell characteristics downstream of Six1 in human breast cancer［J］.Oncogene，2012，31(50):5162-5171.

［27］ Xu X，Chen Z，Zhao X，et al.MicroRNA-25 promotes cell migration and invasion in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，421(4):640-645.