張梁宇 王翔 陸亞琪 朱曉楊 陳揚

喜樹堿對HaCaT細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)的影響

張梁宇 王翔 陸亞琪 朱曉楊 陳揚

目的 觀察喜樹堿對低氧（2%O2）培養(yǎng)下HaCaT細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）表達(dá)的影響，探討外用喜樹堿治療銀屑病可能的作用機(jī)制。方法 將HaCaT細(xì)胞分為實驗組和溶媒組（對照組），實驗組為喜樹堿+DMEM培養(yǎng)液，終濃度分別為12.5、25、50、100、200 nmol/L；溶媒組為含二甲基亞砜（DMSO）的DMEM培養(yǎng)液。不同濃度的喜樹堿作用于HaCaT細(xì)胞12、24、48、72 h，CCK8法檢測細(xì)胞增殖；用以上濃度處理低氧誘導(dǎo)12 h的HaCaT細(xì)胞，Western印跡檢測細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)。將HaCaT細(xì)胞分為常氧組和低氧組，每組內(nèi)再分喜樹堿干預(yù)組（100 nmol/L）和非干預(yù)組（溶媒對照組），培養(yǎng)12 h后實時熒光定量PCR檢測HIF-1α mRNA的相對表達(dá)。統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行Levene′s test、單因素方差分析、Dunnett-t檢驗和析因分析。結(jié)果 不同濃度喜樹堿作用12、24、48、72 h后對HaCaT細(xì)胞的增殖有抑制作用，呈濃度和時間依賴關(guān)系；200 nmol/L喜樹堿作用12 h，100、200 nmol/L喜樹堿作用24 h細(xì)胞增殖抑制率分別為（17.66±6.46）%、（33.11±4.63）%、（56.31± 1.69）%，與同時段溶媒對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05）。低氧誘導(dǎo) 12 h，25、50、100、200 nmol/L喜樹堿處理后 HIF-1α蛋白表達(dá)分別為0.348±0.065、0.261±0.112、0.115±0.043、0.045±0.024，與溶媒組（1.445±0.329）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。喜樹堿干預(yù)（100 nmol/L）與非干預(yù)的HIF-1α mRNA表達(dá)（△Ct值）分別為：常氧組-5.575±0.29、-5.451±0.21；低氧組-6.543±0.57、-6.203±0.31；低氧較常氧條件下HaCaT細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.856，P＜0.05）；喜樹堿干預(yù)和非干預(yù)組間HaCaT細(xì)胞HIF-1α mRNA的表達(dá)在常氧和低氧條件下差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.667，P＞0.05）。結(jié)論 100 nmol/L喜樹堿可抑制HaCaT細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)，對HIF-1α mRNA的表達(dá)水平無明顯影響。

銀屑病；喜樹堿；缺氧誘導(dǎo)因子1；細(xì)胞低氧；HaCaT細(xì)胞

喜樹堿是從我國特有的山茱萸珙桐科植物喜樹樹皮、樹葉、樹枝及果實中提取的一種生物堿，可靶向選擇性抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoisomerase，Topo I），阻礙DNA鏈的閉合，導(dǎo)致細(xì)胞DNA單鏈斷裂、細(xì)胞死亡［1］。研究表明，喜樹堿可抑制人HaCaT細(xì)胞端粒酶活性，抑制其增殖、誘導(dǎo)凋亡［2］，并在低氧模擬下能顯著抑制HeLa和HEK293細(xì)胞系低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表達(dá)［3］。本研究旨在觀察喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響，探討外用喜樹堿治療銀屑病的可能作用機(jī)制。

資料與方法

一、材料及主要試劑

喜樹堿（含量＞95%）為日本東京化成工業(yè)公司產(chǎn)品，4℃保存。HaCaT細(xì)胞系來源于第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院中心實驗室。二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma-Aldrich公司），胰酶（以色列Bioind公司）、DMEM培養(yǎng)基（美國Coring公司），胎牛血清（德國PAN-Biotech GmbH公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)公司），兔抗人HIF-1α單克隆抗體（美國Abcam公司）。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及低氧處理：HaCaT細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于各項實驗。預(yù)先設(shè)定低氧培養(yǎng)箱氣體濃度為 2%O2、5%CO2、93%N2；氧濃度穩(wěn)定為2%時，迅速將HaCaT細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，待氧濃度重新穩(wěn)定于2%后，培養(yǎng)12 h。

2.藥物處理及分組：喜樹堿以DMSO溶解后，-20℃避光保存，喜樹堿儲備濃度為5 g/L。使用時用DMEM培養(yǎng)液稀釋成工作濃度，DMSO的終濃度≤0.1%。將HaCaT細(xì)胞分為實驗組和溶媒組（對照組），實驗組加喜樹堿 +含 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，即喜樹堿的終濃度分別為12.5、25、50、100、200 nmol/L；溶媒組為含 DMSO 的 DMEM 培養(yǎng)液（體積比為0.02∶100）。

3.CCK8檢測細(xì)胞增殖抑制率：將對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞（1×104/ml）接種于96孔板，每孔100 μl在 37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng) 24 h；去上清液，實驗組每孔加入含一定濃度（12.5、25、50、100、200 nmol/L）喜樹堿的 DMEM 培養(yǎng)基 100 μl，每一濃度設(shè)6個復(fù)孔，對照組加入含0.02 μl DMSO的DMEM培養(yǎng)液100 μl，空白組不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基。分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h 后，每孔加入含 10 μl CCK8 溶液的無血清培養(yǎng)基 100 μl，37 ℃、5%CO2下孵育1 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長下測量各孔吸光值，細(xì)胞增殖抑制率=［1-（加藥組各濃度平均吸光度值-空白組平均吸光度值）/（對照組平均吸收值-空白組平均吸光度值）］×100%。

4.Western印跡檢測HIF-1α蛋白的表達(dá)：將對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞（2×105/ml）接種于6孔板中，每孔2 ml，24 h后，棄上清液，實驗組加入含有不同濃度（12.5、25、50、100、200 nmol/L）的喜樹堿2 ml，對照組以等體積溶媒代替藥物，同時放入低氧（2%O2）誘導(dǎo)箱中分別誘導(dǎo)12 h后，收集各組細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA法定量試劑盒檢測蛋白濃度：上樣200 μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗人HIF-1α單克隆抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST漂洗 3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000）室溫下結(jié)合2 h，洗膜5次后顯色，凝膠成像儀顯影。

5.實時定量RT-PCR檢測HIF-1α mRNA的表達(dá)：實驗分為常氧組和低氧組，每組內(nèi)再分喜樹堿干預(yù)組（100 nmol/L）和非干預(yù)組（溶媒對照組），處理時間均為12 h。收集各組細(xì)胞，采用Trizol一步法，常規(guī)方法提取RNA，按RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并建立PCR反應(yīng)體系。各組均取1 μl cDNA作為PCR反應(yīng)模板，加入SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）10 μl及上、下游引物（濃度 5 μmol/L）各 1 μl，最后加無 DNsae-RNsae 水至總體積20 μl。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，共 40個循環(huán)，于每個循環(huán)延伸段采集熒光信號。以β肌動蛋白為內(nèi)參照，計算目的基因的相對定量△Ct及依此進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。引物序列：HIF-1α上游引物5′-CCAGTTACGTTCCTTCGATCAGT-3′，下游引物 5′-TTTGAGGACTTGCGCTTTCA-3′。β肌動蛋白上游引物 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物5′-ACCATCACGCCCTGGTGCCT-3′。

6.統(tǒng)計學(xué)處理：實驗重復(fù)3次，取均數(shù)。用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以±s表示，用Levene檢驗方差齊性，方差不齊，進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換；采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。組內(nèi)各實驗組與溶媒組比較采用Dunnett-t檢驗。HIF-1α mRNA的表達(dá)采用析因設(shè)計的方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、喜樹堿對HaCaT細(xì)胞增殖抑制作用

與溶媒組比較，12.5、25、50、100、200 nmol/L 喜樹堿作用 12、24、48、72 h對 HaCaT 細(xì)胞均有抑制作用，且與時間、濃度呈依賴關(guān)系。隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，喜樹堿對HaCaT細(xì)胞的生長抑制率逐漸增高，見表1。

與溶媒組相比，200 nmol/L喜樹堿作用12 h后就開始對HaCaT細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，一直到72 h該抑制作用仍很明顯（P＜0.05）；100 nmol/L喜樹堿作用24 h后開始產(chǎn)生明顯的抑制作用，并且持續(xù)到72 h時，抑制作用仍然明顯（P＜ 0.05）；50 nmol/L 喜樹堿作用 48、72 h時對HaCaT細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用（P＜0.05）；25 nmol/L喜樹堿作用72 h后才產(chǎn)生明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。喜樹堿處理HaCaT細(xì)胞 24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是 125.58、41.91、23.95 nmol/L。

二、喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)影響

表1 不同濃度喜樹堿在不同時間對HaCaT細(xì)胞增殖抑制率（%，±s）

表1 不同濃度喜樹堿在不同時間對HaCaT細(xì)胞增殖抑制率（%，±s）

注：n=3。a：與同時段溶媒組比較，P＜0.05

組別（nmol/L） 12 h 24 h 48 h 72 h喜樹堿12.5 nmol/L - 7.59±1.89 6.37±5.79 16.35±3.58 25 nmol/L 2.28±2.11 8.78±2.87 28.69±8.92 61.77±8.13a 50 nmol/L 4.79±5.62 17.11±6.56 57.08±7.88a79.50±7.54a 100 nmol/L 4.67±3.33 33.11±4.63a 85.03±5.31a93.78±3.12a 200 nmol/L 17.66±6.46a 56.31±1.69a 95.10±2.03a98.18±0.46a溶媒組 2.40±4.11 2.14±1.31 3.06±2.90 8.64±7.86

如圖 1所示，不同濃度喜樹堿（12.5、25、50、100、200 nmol/L）作用于低氧誘導(dǎo)（2%O2）的 HaCaT細(xì)胞12 h，HIF-1α蛋白的表達(dá)隨喜樹堿濃度的升高而下調(diào)，并在100、200 nmol/L喜樹堿濃度下被明顯抑制。經(jīng)單因素方差分析，各濃度喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)有差異（數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后Levene檢驗顯示方差齊性，P=0.126；F=31.527，P＜ 0.05）。組間多重比較顯示，25、50、100、200 nmol/L喜樹堿處理后HIF-1α表達(dá)（分別為0.348 ± 0.065、0.261 ± 0.112、0.115 ± 0.043、0.045 ±0.024）與溶媒組（1.445±0.329）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 不同濃度喜樹堿對低氧（2%O2）誘導(dǎo)12 h HaCaT細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)

三、喜樹堿對低氧誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)影響

100 nmol/L喜樹堿對常氧和低氧條件下HaCaT細(xì)胞作用12 h后HIF-1α mRNA的表達(dá)水平與相應(yīng)的對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.667，P＞0.05）。但低氧組與常氧組比較HIF-1α mRNA的表達(dá)量相對降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.856，P＜0.05）。見表 2。

討 論

HIF-1是一種氧依賴轉(zhuǎn)錄活因子，是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄活性核蛋白，由α亞基和β亞基組成異源二聚體，其活性形式為HIF-1α。尋常性斑塊型銀屑病皮損角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖，可造成局部微環(huán)境缺氧。研究表明，銀屑病皮損組織中HIF-1α的表達(dá)相對于特應(yīng)性皮炎、脂溢性皮炎或正常皮膚組織均明顯增加［4-5］，并可調(diào)控與銀屑病皮損真皮乳頭層血管增生相關(guān)的多種靶基因表達(dá)，如，血管內(nèi)皮生長因子、環(huán)氧合酶2、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、基質(zhì)金屬蛋白酶 2［6-8］。HIF-1α與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT-1）表達(dá)呈正相關(guān)，并可能參與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖角化不全［9］。因此本研究以低氧誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞為模型，觀察喜樹堿對HIF-1α表達(dá)的影響。

本實驗中，25、50、100、200 nmol/L 喜樹堿均能抑制HaCaT細(xì)胞的增殖活性，隨著藥物濃度升高和作用時間延長，呈濃度和時間依賴關(guān)系。200、100、50、25 nmol/L 喜樹堿分別于作用 12、24、48、72 h后開始對 HaCaT 細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并且持續(xù)到72 h時（P＜0.05），而喜樹堿作用 HaCaT 細(xì)胞 24、48、72 h 的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別是 125.58、41.91、23.95 nmol/L。用 12.5、25、50、100、200 nmol/L 喜樹堿處理低氧誘導(dǎo)12 h的HaCaT細(xì)胞，隨著喜樹堿濃度增加，對HIF-1α蛋白表達(dá)抑制作用也增強(qiáng)（圖1），除12.5 nmol/L喜樹堿外，其余4個濃度喜樹堿對細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)與對照組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。以上結(jié)果均提示低濃度喜樹堿可抑制HaCaT細(xì)胞增殖，抑制HIF-1α蛋白表達(dá)的藥物濃度較增殖抑制濃度低。

表2 喜樹堿對不同氧壓條件處理的HaCaT細(xì)胞HIF-1α mRNA相對表達(dá)量的影響（±s）

表2 喜樹堿對不同氧壓條件處理的HaCaT細(xì)胞HIF-1α mRNA相對表達(dá)量的影響（±s）

注：n=3

組別 不同氧壓條件常氧組（21%O2） 低氧組（2%O2）喜樹堿100 nmol/L 0.021 297±0.004 252 0.011 549±0.005 569溶媒組 0.023 664±0.003 441 0.013 824±0.002 800

本實驗低氧誘導(dǎo)12 h的HaCaT細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)較常氧組降低（P＜0.05），該現(xiàn)象可能與細(xì)胞急性缺氧有關(guān)，尚需對多個時間點進(jìn)一步觀察。Bosco等［10］觀察到低氧誘導(dǎo) 16 h，人外周血單核細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)下降，認(rèn)為可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。100 nmol/L濃度喜樹堿作用低氧誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞12h，細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)被明顯抑制，分別觀察同一濃度和時間點喜樹堿對常氧或低氧狀態(tài)下HaCaT細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)HIF-1α mRNA在喜樹堿干預(yù)前后的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。Bertozzi等［3］以 0.5 μmol/L 喜樹堿作用于去鐵胺低氧模擬下的HeLa和HEK293細(xì)胞系，兩種細(xì)胞系HIF-1α蛋白水平均被明顯抑制，HeLa細(xì)胞系HIF-1α mRNA表達(dá)無明顯變化，進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)抑制miR-17-5p、miR-155表達(dá)后，能影響喜樹堿對HIF-1α蛋白表達(dá)的抑制，提示喜樹堿是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，喜樹堿對HaCaT細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)的調(diào)控也可能是轉(zhuǎn)錄后水平。

臨床上，0.03%喜樹堿軟膏被推薦治療慢性斑塊型銀屑病，療效與0.02%丙酸氯倍他索霜相似［11］，其藥理機(jī)制尚不清楚。文獻(xiàn)［12］報道咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病鼠模型，氯倍他索可通過抑制IL-23/IL-17A炎癥反應(yīng)軸對小鼠皮損有治療作用，但喜樹堿對該炎癥軸無明顯抑制作用，不能有效治療小鼠銀屑病樣皮損表皮增殖。喜樹堿有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，對HaCaT細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)有明顯抑制，喜樹堿對慢性斑塊狀銀屑病的治療作用是否與調(diào)控HIF-1α蛋白有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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2014-12-17）

（本文編輯：吳曉初）

Effects of camptothecin on the expression of hypoxia-inducible factor-1α in HaCaT cells

Zhang Liangyu,Wang Xiang,Lu Yaqi,Zhu Xiaoyang,Chen Yang.Department of Dermatology,98th Hospital of PLA;98 Clinical Medical College Affiliated to Anhui Medical University,Huzhou 313000,Zhejiang,China

Chen Yang,Email：98cy@163.com

ObjectiveTo estimate the effects of camptothecin （CPT）on the expression of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）in HaCaT cells under hypoxic conditions （2%O2）,and to explore the potential therapeutic mechanism of topical CPT for psoriasis.MethodsSome HaCaT cells were classified into 6 groups：5 test groups cultured in Dulbecco′s modified Eagle′s medium（DMEM）with the presence of CPT at 12.5,25,50,100 and 200 nmol/L respectively,and 1 control group cultured in DMEM with the presence of dimethyl sulfoxide（DMSO）.All the 6 groups of cells were cultured under normoxic conditions for 12,24,48 or 72 hours or under hypoxic conditions for 12 hours.Cell counting kit-8 （CCK-8）assay was conducted to estimate the proliferation of HaCaT cells after the normoxic culture,and Western blot to quantify the protein expression of HIF-1α after the hypoxic culture.Some HaCaT cells were classified into a normoxia group（21%O2）and a hypoxia group（2%O2）,and each group was divided into a CPT（100 nmol/L）-treated subgroup and a non-intervention subgroup（treated with the vehicle）.After 12-hour culture,real-time fluorescencebased quantitative PCR was performed to measure the mRNA expression of HIF-1α.Statistical analysis was carried out by using Levene′.s test,one-way analysis of variance,Dunnett-ttest and factorial analysis with the SPSS16.0 software.ResultsAfter treatment with CPT at 12.5－200 nmol/L for 12－72 hours,the proliferation of HaCaT cells was inhibited in a concentration-and time-dependent manner.More concretely,the cell proliferation rates were inhibited by 17.66%±6.46%,33.11%±4.63%and 56.31%±1.69%respectively in HaCaT cells after 12-hour treatment with 200 nmol/L CPT as well as 24-hour treatment with 100 and 200 nmol/L CPT compared with the control group at the corresponding time points（allP＜0.05）.The protein expression level of HIF-1α was significantly decreased in HaCaT cells after 12-hour treatment with CPT at 12.5,25,50,100 and 200 nmol/L under hypoxic conditions compared with the control group（0.348±0.065,0.261±0.112,0.115±0.043,0.045±0.024 vs.1.445±0.329,allP＜0.05）.The mRNA expression level of HIF-1α（expressed as△Ct）in the CPT-treated subgroup and non-intervention subgroup was－5.575 ± 0.29 and－5.451±0.21 respectively in the normoxia group,significantly higher than that in the hypoxia group（－6.543±0.57 and－6.203±0.31 respectively,F=29.856,P＜0.05）,while there was no significant difference between the CPT-treated and non-intervention subgroups（F=1.667,P＞0.05）.ConclusionsCPT at 100 nmol/L could inhibit the expression of HIF-1α protein,but had no obvious effect on that of HIF-1α mRNA.

Psoriasis;Camptothecin;Hypoxia-inducible factor 1;Cell hypoxia;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.010

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新項目（12Z03）；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目（13QNP045）

313000浙江湖州，安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍九八臨床學(xué)院，解放軍第九八醫(yī)院皮膚科

陳揚，Email：98cy@163.com