高慧劉晶晶沈姍姍梁少明危林耿王沙燕

1暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院（深圳518020）

2亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司（深圳518133）

【摘要】目的應用FMCA技術(shù)檢測雙側(cè)前庭水管擴大家系SLC26A4基因，探討前庭水管擴大與SLC26A4基因的關(guān)系及FMCA技術(shù)最優(yōu)條件。方法收集EVA家系臨床資料，基于熒光定量PCR熔解曲線平臺，運用FMCA技術(shù)分析107例正常人，6個EVA家系19位成員的SLC26A4基因IVS7-2A>G（919-2A>G），2168A>G及1229C>T突變位點。并用直接測序技術(shù)予以驗證。結(jié)果107例正常人中有2例SLC26A4基因雜合突變，突變率為1.87%；EVA家系中有3例SLC26A4基因純合突變，3例SLC26A4基因復合雜合突變，10例SLC26A4基因雜合突變，3例無SLC26A4基因突變，SLC26A4基因突變率為84.21%。對家系a進行產(chǎn)前診斷，結(jié)果為IVS7-2A>G/1229C>T復合雜合突變。所有檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，符合率為100%。結(jié)論 FMCA平臺能快速檢測SLC26A4基因的IVS7-2A>G，2168A>G與1229C>T突變，其操作簡單，成本低。且經(jīng)測序技術(shù)驗證，結(jié)果準確。可作為診斷遺傳性疾病及產(chǎn)前診斷的快速有效方法。

【關(guān)鍵詞】耳聾；前庭水管擴大；SLC26A4基因；FMCA；探針熔解曲線分析技術(shù)

【中圖分類號】R714.5　【文獻標識碼】A　【文章編號】1672-2922（2015）03-536-05

FMCA技術(shù)分析大前庭水管綜合征家系及產(chǎn)前診斷

高慧1劉晶晶2沈姍姍1梁少明2危林耿2王沙燕1

1暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院（深圳518020）

2亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司（深圳518133）

【摘要】目的應用FMCA技術(shù)檢測雙側(cè)前庭水管擴大家系SLC26A4基因，探討前庭水管擴大與SLC26A4基因的關(guān)系及FMCA技術(shù)最優(yōu)條件。方法收集EVA家系臨床資料，基于熒光定量PCR熔解曲線平臺，運用FMCA技術(shù)分析107例正常人，6個EVA家系19位成員的SLC26A4基因IVS7-2A>G（919-2A>G），2168A>G及1229C>T突變位點。并用直接測序技術(shù)予以驗證。結(jié)果107例正常人中有2例SLC26A4基因雜合突變，突變率為1.87%；EVA家系中有3例SLC26A4基因純合突變，3例SLC26A4基因復合雜合突變，10例SLC26A4基因雜合突變，3例無SLC26A4基因突變，SLC26A4基因突變率為84.21%。對家系a進行產(chǎn)前診斷，結(jié)果為IVS7-2A>G/1229C>T復合雜合突變。所有檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，符合率為100%。結(jié)論 FMCA平臺能快速檢測SLC26A4基因的IVS7-2A>G，2168A>G與1229C>T突變，其操作簡單，成本低。且經(jīng)測序技術(shù)驗證，結(jié)果準確。可作為診斷遺傳性疾病及產(chǎn)前診斷的快速有效方法。

【關(guān)鍵詞】耳聾；前庭水管擴大；SLC26A4基因；FMCA；探針熔解曲線分析技術(shù)

【中圖分類號】R714.5【文獻標識碼】A【文章編號】1672-2922（2015）03-536-05

耳聾是人類生活中常見的疾病，2006年第二次殘疾人抽樣調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國聽力殘疾達2004萬，占殘疾人總?cè)藬?shù)的24.16%[1]，前庭水管擴大（En?large Vestibular Aqueduct,EVA）是一種常見的與感音神經(jīng)性耳聾相關(guān)的內(nèi)耳畸形[2]，1996年Griffith[3]首次描述前庭水管擴大的家族遺傳性，隨后其被證實與SLC26A4、FOXI1及KCNJ10基因有關(guān)[4-6]。SLC26A4基因是我國第二常見的致聾基因，其突變可致EVA伴非綜合征型常染色體隱性遺傳性耳聾（DFNB4）及Pendred綜合癥（PDS）[2]。研究發(fā)現(xiàn)SLC26A4基因具有種族特異性，T416P及IVS8+1G>A突變在北歐最常見，2168A>G突變在日本及韓國最常見，我國最常見突變位點是 IVS7-2A>G（919-2A>G），其次為2168A>G、1975G>C、1174A>T、IVS15+5G>A及1229C>T[2,7]。

目前，我國耳聾的臨床診斷主要平臺有基因芯片技術(shù)，飛行質(zhì)譜儀及測序技術(shù)等方法[8]，但這些方法操作復雜，成本較高并且需要特殊的儀器。多色熒光熔解曲線分析技術(shù)（Multiplex FluorescenceMelt?ing Curve Analysis，F(xiàn)MCA）是基于熒光PCR熔解曲線平臺，利用野生型和突變型模板DNA與探針匹配的堿基數(shù)不同，獲得不同的Tm值，從而進行已知突變檢測、基因分型及未知突變篩查[9]。該技術(shù)汲取了染料熔解曲線Tm值分型技術(shù)及熒光PCR多色多通道的雙重優(yōu)點，對基因每個突變位置只需設(shè)計一條探針，利用不同波長的熒光標記，即可實現(xiàn)多色多通道多位點的定性檢測[9]。目前國內(nèi)外已有少量文獻報道利用熔解曲線技術(shù)分析致聾基因[10,11]，但國內(nèi)尚未見到利用TaqMan探針結(jié)合熔解曲線技術(shù)檢測SLC26A4基因的報道，本文利用TaqMan探針結(jié)合熔解曲線建立快速可靠的FMCA診斷技術(shù)，分析107例正常人，19例EVA家系成員的SLC26A4基因IVS7-2A>G、2168A>G及1229C>T突變位點，探討前庭水管擴大與SLC26A4基因的關(guān)系及FMCA技術(shù)的最優(yōu)檢測條件。

1　資料與方法

1.1研究對象

遵循知情同意的原則，收集來自深圳市人民醫(yī)院就診的107例聽力正常及內(nèi)耳結(jié)構(gòu)無異常的人群以及6個EVA小家系的19位成員。其中，家系a先證者母親腹中孕有一胎兒，共兩代4人；其余家系均為兩代3人（圖1）。

1.2樣本采集與DNA提取

采用EDTA-K2抗凝管采集所有受試者的外周血2-3m l，胎兒基因檢測選擇在產(chǎn)婦孕中期（17周-23周）抽取羊水5-10ml。DNA提取采用德國QIAGEN公司的QIAamp DNA抽提試劑盒，按照提取步驟說明書提取DNA。取1.5ulDNA用Nanodrop 2000進行DNA純度及濃度檢測。

1.3制備標準品及繪制標準曲線

IVS7-2A>G位于SLC26A4基因exon7與exon8之間的內(nèi)含子上，2168A>G位于exon19，1229C>T突變位于exon10，選擇優(yōu)化好的引物及PCR反應程序?qū)LC26A4基因exon7+8，10和19進行擴增，獲得PCR產(chǎn)物送至上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司進行克隆及構(gòu)建突變位點，然后將構(gòu)建好的質(zhì)粒進行測序驗證其準確性。利用構(gòu)建的IVS7-2A>G，2168A>G及1229C>T突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒進行FMCA檢測，并繪制標準曲線。

1.4方法

1.4.1引物及探針設(shè)計

應用Primer5.0及Oligo7.0設(shè)計相應位點的引物及TaqMan探針（表1），并將探針及引物在NC?BI-BLAST上進行序列同源性比對，送至上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

表1　引物及探針序列

1.4.2不對稱PCR反應體系及反應條件優(yōu)化

25ul反應體系：1×buffer，3.0mM MgCl2，200uM dNTPs，2.5U Taq酶，2.5U Taq Antibody，各上游引物0.4uM，各下游引物0.04uM(1229C>T上下游引物用量相反)，各TaqMan探針0.4 uM，20 ng DNA（50000copies質(zhì)粒），加蒸餾水補至25ul。反應條件：第一步PCR擴增：95℃預變性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，40個循環(huán)；第二步熔解曲線：95℃1min，40℃1min，以0.01℃/S的升溫速率從40℃升至85℃并每升高1℃收集10次熒光。儀器選擇：RocheLightCycler480-Ⅱ。

1.5測序驗證

按照文獻所述方法[12]將所有受試者DNA進行PCR擴增獲得SLC26A4基因exon7+8，exon10和ex?on19，采用QIA quick PCR試劑盒將所得PCR產(chǎn)物進行純化，利用ABI3130 DNA全自動測序儀進行正反向測序，最后將測序結(jié)果用DNAstar軟件進行分析。

1.6統(tǒng)計學分析

利用SPSS13.0軟件，選擇卡方檢驗進行統(tǒng)計學分析，比較對照組與試驗組之間差異有無統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1FMCA結(jié)果

2.1.1標準曲線的繪制

利用FMCA技術(shù)分析已構(gòu)建好的野生型及突變型質(zhì)粒樣品，獲得不同的Tm的熔解曲線（圖2），結(jié)果顯示：IVS7-2A>G野生型Tm為（61.5±0.5）℃，突變型Tm為（67.0±0.5）℃；2168A>G野生型Tm為（61± 0.5）℃，突變型Tm為（67.0±0.5）℃；1229C>T野生型Tm為（74.0±0.5）℃，突變型（68.0±0.5）℃。

2.1.2FMCA結(jié)果分析

對107例正?；颊哌M行FMCA分析，結(jié)果顯示2例存在IVS7-2雜合突變，其余均未發(fā)現(xiàn)突變，突變率為1.87%。6個EVA家系分析顯示，來自5個家系的16位成員攜帶SLC26A4基因突變，其中3例為IVS7-2A>G純合突變，8例IVS7-2A>G雜合突變，1例2168A>G雜合突變，1例IVS7-2A>G/2168A>G雙重雜合突變，1例1229C>T雜合突變，2例IVS7-2A>G/ 1229C>T雙重雜合突變，其遺傳方式均符合常染色體隱性遺傳。1個家系未檢出SLC26A4基因突變。（表2）

2.2PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

對所有受試者的SLC26A4基因exon7+8，10和19測序結(jié)果與FMCA技術(shù)檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%。(表3)

2.3統(tǒng)計學分析

卡方檢驗結(jié)果顯示P=0.000（<0.05）,認為對照組與實驗組之間差異有統(tǒng)計學意義。

3　討論

SLC26A4基因與前庭水管擴大伴非綜合征型常染色體隱性遺傳性耳聾密切相關(guān)，并且各國及種族之間有較大的差異，高加索人約有40%前庭水管擴大相關(guān)內(nèi)耳畸形（EVA和Mondini畸形）患者攜帶有SLC26A4基因突變，日本約有78%，韓國約有92%；而我國則有97.9%，其中IVS7-2A>G最常見（57.63%），只有2.1%患者無SLC26A4突變[7]。2014年解放軍總醫(yī)院學者研究2686例就診患者，結(jié)果顯示SLC26A4基因致病突變?nèi)吭谇巴ニ軘U大相關(guān)內(nèi)耳畸形病人中檢出[14]；并且雙側(cè)前庭水管擴大或單側(cè)前庭水管擴大與SLC24A6基因的關(guān)系有明顯的不同，雙側(cè)前庭水管擴大SLC26A4基因突變檢出率為95.97%，而單側(cè)僅為29.41%[15]。本文研究中正常樣本人群共107人，有2例SLC26A4單等位基因突變，并且為最常見的IVS7-2A>G突變，突變率為1.87%，與其他文獻所報道的人群突變率基本一致[16]。6個EVA家系先證者聽力學檢測均為雙耳重度或極重度感音神經(jīng)性耳聾，其中5例基因檢測為純合突變或復合雜合突變，1例無突變檢出；所有家系成員基因檢測結(jié)果顯示84.21%攜帶SLC26A4基因突變，其中IVS7-2A>G突變頻率最高，由于陽性樣本量較小所以突變率與其他文獻相比會有少許偏倚，經(jīng)統(tǒng)計學分析顯示試驗組與對照組的突變率差異有統(tǒng)計學意義，認為EVA家系攜帶SLC26A4基因突變率高于正常人群。其中家系a中IIa-2為孕中期胎兒，基因檢測為IVS7-2A>G/ 1229C>T復合雜合突變（圖2BC）；Ⅰa-1與Ⅰa-2均為雜合突變，臨床表型正常，為復合雜合突變，臨床表型為極重度感音神經(jīng)性耳聾伴雙側(cè)前庭水管擴大，根據(jù)文獻報道[12]及常染色體隱性遺傳規(guī)律推斷該胎兒極有可能是聾兒。本研究家系e在SLC26A4基因exon7+8，10和19上均無突變；由于耳聾可由多種因素導致，并且SLC26A4基因突變位點已報道上百種（http://deafnessvariationdatabase.org/），SLC26A4基因常見的突變位點不足以確定該家系致聾原因，所以家系e的致聾原因仍需要近一步研究。

表2　EVA家系分析

目前，新一代測序技術(shù)已成為單基因遺傳病檢測的熱門方法，也是全球普及的高通量測序技術(shù)，可并行對幾百萬個DNA分子同時測序，快速篩選致病基因及未知突變[17]。2010年新一代測序技術(shù)已成功應用于耳聾相關(guān)新基因的篩選[18]；同年，Shearer等[19]成功地將新一代測序技術(shù)應用于耳聾基因的臨床檢測。近年來，耳聾相關(guān)新基因及新突變位點的發(fā)現(xiàn)數(shù)量呈直線上升與新一代測序技術(shù)的應用及發(fā)展密不可分[8]。但由于儀器昂貴、捕獲目的區(qū)域的偏倚及數(shù)據(jù)分析等難題[17]，導致新一代測序技術(shù)從實驗室到臨床應用還有較長一段路程。而FMCA分析技術(shù)[9]基于熒光PCR，操作簡單，結(jié)果可靠，更加便于在醫(yī)院實施；目前已在臨床上實現(xiàn)β-地中海貧血24個突變位點檢測[20]，G6PD基因16個突變位點分析[21]及結(jié)合桿菌耐藥性檢測[22]等遺傳病及病原體的診斷。本實驗即是利用TaqMan探針及不對稱PCR體系，建立快速可靠的FMCA技術(shù)檢測SLC26A4基因，結(jié)果顯示IVS7-2A>G野生型Tm與突變型Tm相差（ΔTm）約5.3℃；2168A>G的ΔTm約6.5℃；1229C>T的ΔTm約6℃?？梢娨吧团c突變型Tm值相差約5℃以上，易于分型，結(jié)果簡單易讀，通過測序驗證顯示其符合率為100%。一般認為熔解曲線分析應選用不被水解的探針，如利用雜交探針結(jié)合熔解曲線分析載脂蛋白E基因型[23]；運用堿基淬滅探針結(jié)合熔解曲線技術(shù)分析線粒體DNA 12SrRNA的1555A>G與1494C>T突變[11]。本研究選用普通的TaqMan水解探針，較其他探針設(shè)計簡單，合成方便及成本低，且在熔解曲線分析中不受Taq酶影響[9]，并可獲得較高的熔解曲線峰值；但其要注意試驗成功的關(guān)鍵條件：（1）探針的設(shè)計：選擇較低特異性、能與野生鏈及突變鏈有效結(jié)合的探針，一般探針長度較長（表1）；探針突變堿基為C（C-G/A）的ΔTm大于T（T-G/A）（圖3AB），更適用于雜合子分析。（2）不對稱PCR：引物比為10：1體系優(yōu)于1：1的體系（圖3）。（3）實驗顯示Tm值存在批間差異，每次實驗必須建立標準曲線。

表3　FMCA方法檢測SLC26A4基因的評價

前庭水管擴大伴非綜合征型常染色體隱性遺傳性耳聾與SLC26A4基因密切相關(guān)，利用FMCA平臺成功檢測SLC26A4基因的IVS7-2A>G、2168A>G與1229C>T突變，其操作簡單，成本低；且經(jīng)測序技術(shù)驗證，符合率為100%；可作為診斷遺傳性疾病及產(chǎn)前診斷的快速有效方法。由于本實驗納入陽性樣本量過少，并且檢測位點局限，實現(xiàn)高通量多位點的FMCA技術(shù)仍需要進一步加深研究。

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App lication of FMCA in fam iliesw ith enlarge vestibular aqueductand in prenataldiagnosis

GAOHui1,LIU Jingjing2,SHEN Shanshan1,LIANGShaoming2,WEILingeng2,WANGShayan1
1 Second ClinicalMedicalCollegeof Jinan University,Shenzhen People'sHospital,Shenzhen 518020,China
2 Yaneng Bioscience(Shenzhen)Co.Ltd,518133,China
Corresponding author:WANGShayan,Email:shayanw@yahoo.com

Objective To report applications of the FMCA technology for testing the SLC26A4 gene in fam iliesw ith bilateral enlarged vestibular aqueduct(EⅤA)to analyze relations between EⅤA and SLC26A4 and to determ ine conditions for optimization of the FMCA technology.Methods Clinical data of EⅤA familieswere collected.ⅠⅤS7-2A>G,2168A>G, 1229C>Tmutations of the SLC26A4 gene in 107 normal controls and 19 subjects from 6 EⅤA familieswere analyzed by FMCA technology and resultswere confirmed w ith directDNA sequencing.Results Heterozygousmutations of SLC26A4 were detected in 2 subjects among the 107 normal controls(1.87%).Ⅰn the EⅤA fam ilies,homozygousmutations of the SLC26A4 genewas detected in 3 subjects,compound heterozygousmutations in 3 subjects and simple heterozygousmutations in 10 subjects(84.21%),and 3 subjects showed nomutations.The technology was used in prenatal diagnosis in one fam ily and showedⅠⅤS7-2A>G/1229C>T compound heterozygousmutationsof the SLC26A4 gene.A ll resultswere consistentw ith DNA sequencing.Conclusion Our study shows that FMCA can quickly detectⅠⅤS7-2A>G,2168A>G,1229C>T mutationsof the SLC26A4 gene.Backed by DNA sequencing,our results indicate that FMCA can be used asa fast,economic and effectivemethod in diagnosisof genetic diseasesand in prenataldiagnosis.

Hereditary hearing loss;EnlargeⅤestibular Aqueduct;SLC26A4;FMCA;Melting Curve Analysis Based on Probes.

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.036

2013年深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金（CXZZ20130517143111780）

高慧，碩士研究生，研究方向：醫(yī)學遺傳學

王沙燕，Email：shayanw@yahoo.com

2015-1-29 審核人：郭維維)