吳冠宇，王 碩，劉 艷，趙淑華

（吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021）

鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一種運(yùn)用廣泛的工業(yè)化學(xué)增塑劑，在受熱、磨損等條件下，PAEs會(huì)與塑料逐步分離擴(kuò)散到環(huán)境或生物體內(nèi)［1－3］。PAEs的毒性遠(yuǎn)高于三聚氰胺，被列為主要的環(huán)境雌激素，是世界上最廣泛存在的污染物［4－6］。作為PAEs中應(yīng)用最為廣泛的一種，鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在土壤、大氣和水體中均有檢出［7］。其中，低相對(duì)分子質(zhì)量的DBP多用于香水、化妝品等產(chǎn)品的生產(chǎn)加工；而高相對(duì)分子質(zhì)量的DBP常添加于醫(yī)療器械、地板膠和墻面漆等產(chǎn)品中，用以增強(qiáng)材料的柔韌性［8－9］。我國(guó)已將 DBP確定為環(huán)境優(yōu)先控制污染物［10］。有研究［11－14］表明：DBP 對(duì)雄性動(dòng)物生殖和發(fā)育的影響包括精子生成障礙、睪酮合成量下降、胚胎畸形、睪丸標(biāo)志酶活性下降和體質(zhì)量減輕等，但其對(duì)生物體的干擾機(jī)制研究尚不充分。本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)雄性小鼠生殖系統(tǒng)抗氧化酶的活性，觀察低劑量DBP對(duì)雄性小鼠生殖系統(tǒng)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，探討其對(duì)小鼠生殖系統(tǒng)毒性作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 健康雄性ICR小鼠40只，體質(zhì)量（18±2）g，購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（吉）2007－0011，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（吉）2007－0003。小鼠于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，隨機(jī)分組分籠飼養(yǎng)，自由攝入食物和飲水，飼養(yǎng)溫度18～24℃，相對(duì)濕度為50%～70%。DBP購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)（純度99.5%、相對(duì)密度1.0463～1.0475g·mL－1），食用玉米油購(gòu)自中糧食品營(yíng)銷(xiāo)有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。TD5A臺(tái)式自動(dòng)平衡離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司），WS2－261－79型電熱恒溫水溫箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠），722型光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠制造），F(xiàn)A1004型上皿電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 動(dòng)物分組和給藥 將40只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和200、400、800mg·kg－1DBP組，每組10只。以玉米油溶解DBP，對(duì)照組小鼠灌胃給予玉米油溶劑，其他各組小鼠根據(jù)半數(shù)致死量（LD50）為8000mg·kg－1分別灌胃給予200、400和800mg·kg－1DBP，每天1次，連續(xù)給藥2和4周，每天觀察小鼠一般狀況、飲食情況和活動(dòng)情況、每天測(cè)量小鼠的體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量［15］。

1.3 觀察指標(biāo) 分別于染毒后2和4周脫臼處死各組5只小鼠。取睪丸，稱(chēng)質(zhì)量，去被膜，冰浴下勻漿，離心，取上清。計(jì)算小鼠睪丸質(zhì)量與體質(zhì)量比值，即睪丸的臟器系數(shù)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定各組小鼠睪丸組織中MDA水平和SOD、GSH－Px活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。各組小鼠睪丸組織中MDA水平和SOD、GSH－Px活性以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù) 染毒2周后，各染毒組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0.05）；染毒4周后，800mg·kg－1DBP組小鼠體質(zhì)量明顯高于對(duì)照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。染毒期間，小鼠體質(zhì)量變化見(jiàn)表1。染毒2周后，各組小鼠睪丸臟器系數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）；染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP組小鼠睪丸臟器系數(shù)明顯低于對(duì)照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量Tab.1 Body weights of mice in various groups（，m／g）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Body weight（week）0 2 4 Control 22.19±1.3629.40±3.3232.70±3.32 DBP（mg·kg－1）200 23.25±1.2929.41±2.7832.34±3.07400 24.07±1.4530.90±2.1734.59±2.52800 23.74±1.6630.28±2.3635.71±2.39＊△

表2 各組小鼠睪丸臟器系數(shù)Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

表2 各組小鼠睪丸臟器系數(shù)Tab.2 Testis organ coefficient of mice in various groups（n＝5，，η／%）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group.

Group Testis organ coefficient（week）2 4 Control 0.73±0.07 0.72±0.09 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.07 0.71±0.04400 0.73±0.11 0.62±0.07＊△800 0.64±0.02 0.60±0.05＊△

2.2 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平 染毒2周后，400和800mg·kg－1DBP組小鼠睪丸組織中MDA水平明顯高于對(duì)照組和200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）；200mg·kg－1DBP組MDA水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）。染毒4周后，200mg·kg－1DBP組MDA水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP組MDA水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），800mg·kg－1DBP組MDA水平明顯高于200和400mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

表3 各組小鼠睪丸組織勻漿中MDA水平Tab.3 MDA levels in testis tissue homogenate of mice in various groups ［n＝5，，mB／（mmol·g－1）prot］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group MDA level in testis homogenate（week）2 4 Control 0.77±0.08 1.25±0.15 DBP（mg·kg－1）200 0.69±0.06＊ 1.04±0.11＊400 0.95±0.08＊△ 1.43±0.12＊△800 1.12±0.07＊△# 1.80±0.13＊△#

2.3 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD活性 染毒2周后，200mg·kg－1DBP組SOD活性明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），800mg·kg－1DBP組SOD活性 明 顯 低 于 對(duì) 照組（P＜0.05），400和800mg·kg－1DBP組SOD活性低于200mg·kg－1DBP組（P＜0.05）。染毒4周后，800mg·kg－1DBP組SOD活性明顯低于對(duì)照組及200、400mg·kg－1DBP組（P＜0.05），其余各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

表4 各組小鼠睪丸組織勻漿中SOD和GSH－Px活性Tab.4 Activities of SOD and GSH－Px in testis tissue homogenate of mice in various groups［n＝5，，mB／（mmol·g－1）］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs 200mg·kg－1DBP group；#P＜0.05 vs 400mg·kg－1DBP group.

Group Activityof SOD（week）Activityof GSH－Px 2 4 Control 6.97±0.93 27.53±2.21 34.72±2.97 17.2 471±0.99 DBP（mg·kg－1）200 7.65±0.64＊ 26.84±2.64 18.26±1.05＊ 25.09±1.96＊400 6.21±0.40△ 25.91±2.67 19.74±1.86＊ 29.42±3.66＊△800 5.67±0.54＊△ 19.69±2.47＊△# 20.02±1.71＊ 24.66±1.38＊#

2.4 各組小鼠睪丸組織勻漿中GSH－Px活性 染毒2周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），各染毒組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。染毒4周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且400mg·kg－1DBP組GSH－Px活性明顯高于200和800mg·kg－1DBP組（P＜ 0.05）。見(jiàn)表4。

3 討 論

氧自由基的堆積可使細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的MDA。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化物的最終產(chǎn)物，其水平不僅反映出機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生的多少，也反映出脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，并間接反映細(xì)胞受損傷的程度［16］。本實(shí)驗(yàn)中，400和800mg·kg－1DBP組MDA水平明顯高于對(duì)照組，并且隨著染毒時(shí)間、劑量增加，MDA水平明顯升高，表明DBP可誘導(dǎo)小鼠睪丸內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化；而200mg·kg－1DBP組MDA水平較對(duì)照組明顯下降，可能是DBP在誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化的同時(shí)也啟動(dòng)了抗氧化系統(tǒng)，使機(jī)體處于代償狀態(tài)，也可能DBP抑制了體內(nèi)的氧化還原過(guò)程。

正常情況下，機(jī)體所產(chǎn)生的自由基會(huì)迅速被體內(nèi)酶系統(tǒng)清除，從而將自由基對(duì)機(jī)體的毒作用降至較低水平。機(jī)體中的抗氧化酶主要有SOD和GSH－Px。SOD為淬滅自由基的酶，并有終止自由基連鎖反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞的作用［17－18］。本研究結(jié)果顯示：染毒2周時(shí)，各染毒組小鼠睪丸組織中SOD活性出現(xiàn)波動(dòng)，4周時(shí)，800mg·kg－1DBP組SOD活性明顯低于對(duì)照組及其他各染毒組?？赡?周時(shí)DBP產(chǎn)生的過(guò)氧化自由基消耗了SOD；而4周時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的酶的量和活性均明顯上升，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但800mg·kg－1DBP組可能產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化的量較多而使SOD明顯消耗。

GSH－Px是機(jī)體主要的含巰基過(guò)氧化酶，其主要是以GSH為基質(zhì)催化自由基的清除和過(guò)氧化物分解。在滅活大量產(chǎn)生的活性氧過(guò)程中，GSH－Px可能有過(guò)多的消耗而導(dǎo)致其活性下降。王玉邦等［19］在研究DBP對(duì)大鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：睪丸組織勻漿中GSH－Px在染毒2周后呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，800mg·kg－1DBP組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在染毒4周后，各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本實(shí)驗(yàn)中，染毒2周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯低于對(duì)照組；而染毒4周后，各染毒組GSH－Px活性均明顯升高，與文獻(xiàn)［19］報(bào)道的結(jié)果不同，這可能與體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用對(duì)酶活性產(chǎn)生的干擾有關(guān)聯(lián)，也表明DBP對(duì)生物體的脂質(zhì)過(guò)氧化作用存在種屬間的差異［20－21］，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異，但染毒4周后，400和800mg·kg－1DBP組睪丸臟器系數(shù)明顯下降，可能與睪丸組織的氧化損傷有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，DBP可誘導(dǎo)小鼠睪丸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，并干擾抗氧化酶的活性，最終可能造成生殖功能損傷。

［1］Bergh C，Torgrip R，Emenius G，et al.Organophosphate and phthalate esters in airand settled dust－a multi－location indoor study ［J］.Indoor Air，2011，21（1）：67－76.

［2］Meeker JD.Exposure to environmental endocrine disrupting compounds and men’s health ［J］.Maturitas，2010，66（3）：236－241.

［3］Kambia N，Dine T，Gressier B，et al.Strong variability of di（2－ethylhexyl）phthalate（DEHP）plasmatic rate in infants and children undergoing 12－h(huán)our cyclic parenteral nutrition［J］.J Parenteral Enteral Nutrit，2013，37（2）：229－235.

［4］武 杰，吳希慶，薩音白剛.鄰苯二甲酸酯類(lèi)塑化劑毒性研究進(jìn)展 ［J］.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（5）：121－123.

［5］李俊儒，胡繼紅，段 瓊，等.我國(guó)鄰苯二甲酸酯類(lèi)檢測(cè)方法研究進(jìn)展 ［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（2）：180－183.

［6］秦曉東，袁欣然，李冬梅，等.鄰苯二甲酸酯類(lèi)的雄性生殖毒性研究進(jìn)展 ［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27（5）：531－535.

［7］董 蕾，張 明.土壤中鄰苯二甲酸二丁酯研究進(jìn)展 ［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)（上半月刊），2011，17（3）：122－123.

［8］李 蕾，宋乃寧，李海山，等.鄰苯二甲酸酯類(lèi)毒理學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2014，28（3）：468－474.

［9］Hines CJ，Hopf NB，Deddens JA，et al.Occupational exposure to diisononyl phthalate（DiNP）in polyvinyl chloride processing operations ［J］.Int Arch Occup Envir Health，2012，85（3）：317－325.

［10］王凱榮，崔明明，史衍璽.農(nóng)業(yè)土壤中鄰苯二甲酸酯污染研究進(jìn)展 ［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24（9）：2699－2708.

［11］Yao PL，Lin YC，Richburg JH.Transcriptional suppression of Sertoli cell Timp2in rodents following mono－（2－ethylhexyl）phthalate exposure is regulated by CEBPA and MYC ［J］.Biol Reprod，2011，85（6）：1203－1215.

［12］Pant N，Pant A，Shukla M，et al.Environmental and experimental exposure of phthalate esters：the toxicological consequence on human sperm ［J］.Hum Exp Toxicol，2011，30（6）：507－514.

［13］Erdos Z，Pearson K，Goedken M，et al.Inhibin B response to testicular toxicants hexachlorophene，ethane dimethanesulfonate，di－（n－butyl）－phthalate，nitrofurazone，DL－ethionine，17－alpha ethinylestradiol，2，5－h(huán)exanedione，or carbendazim following short－term dosing in male rats ［J］.Birth Defects Res B Develop Reprod Toxicol，2013，98（1）：41－53.

［14］吳澤穎，朱 燁，李 威，等.塑料制品中鄰苯二甲酸酯類(lèi)增塑劑的快速篩選 ［J］.塑料科技，2014，42（9）：97－101.

［15］Dobrzyńska MM，Tyrkiel E，Hernik A，et al.The effects of dibutylphthalate on the somatic cells of laboratory mice［J］.Panstwowy Zaklad Higieny，2010，6（11）：13－19.

［16］郭書(shū)周，楊自軍，張 才.高鉬低銅對(duì)小鼠睪丸組織脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響 ［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（11）：145－147.

［17］王 婷，鄭玉建，吳順華，等.砷致小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化及鋅、硒對(duì)其的干預(yù)研究 ［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（6）：551－553.

［18］董 亮，何永志，王遠(yuǎn)亮，等.超氧化物歧化酶（SOD）的應(yīng)用研究進(jìn)展 ［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013，15（5）：53－58.

［19］王玉邦，宋 玲，朱正平，等.鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)大鼠睪丸生化酶及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 ［J］.中華男科學(xué)雜志，2004，10（10）：729－733.

［20］白 葦，韓國(guó)宏.肝細(xì)胞癌的綜合介入治療 ［J］.臨床肝膽病雜志，2013，29（1）：36－37.

［21］陳 潔，姚 敏，姚登福.磷脂酰肌醇蛋白多糖－3介導(dǎo)的信號(hào)道路與肝癌靶向治療 ［J］.臨床肝膽病雜志，2013，29（1）：77－80.