羅國標(biāo)，楊 麗，劉曉麗

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州遵義 563099；2.貴州省黔東南州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 凱里 556000；3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州 遵義 563099）

偏頭痛是一種慢性反復(fù)發(fā)作性頭痛，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。最近幾年的研究［1－2］表明：炎性細(xì)胞因子與偏頭痛的疼痛有關(guān)聯(lián)；三叉神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肽和炎性介質(zhì)在偏頭痛的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用。偏頭痛的經(jīng)典治療藥物曲馬普坦類藥物具有減少神經(jīng)肽、蛋白及血漿滲出，減少偏頭痛血管炎癥反應(yīng)等藥理作用。正清風(fēng)痛寧主要成分為鹽酸青藤堿，其具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)咳等藥理作用，目前已廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。目前尚未見正清風(fēng)痛寧用于治療偏頭痛的文獻(xiàn)報道。本實驗觀察正清風(fēng)痛寧對偏頭痛模型大鼠腦干炎性細(xì)胞因子腫瘤壞子因子α（tumor necrosis factorα，TNF－α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin－1β，IL－1β）表達(dá)及大鼠腦干蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)的影響，以舒馬普坦為陽性對照，了解正清風(fēng)痛寧能否減少蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)及腦干細(xì)胞因子（TNF－α和IL－1β）的表達(dá)從而抑制偏頭痛的無菌性神經(jīng)源性炎癥（aseptic neurogenic inflammation，ANI）反應(yīng)，為正清風(fēng)痛寧臨床用于治療偏頭痛提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 清潔級 Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（260±60）g，購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（渝）2007－0005。硝酸甘油注射液（nitroglycerin，NTG）（5g·L－1，批號：20100531）購自北京益民藥業(yè)有限公司，正清風(fēng)痛寧緩釋片（每片含鹽酸青藤堿60mg，批號：0903127）購自湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，琥珀酸舒馬普坦片（批號：0D6909T）購自天津華津制藥有限公司，兔抗大鼠TNF－α抗體和兔抗大鼠IL－1β抗體購自武漢博士德生物公司。麥克奧迪BA400顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)）。

1.2 實驗分組、模型制作和給藥 Wistar大鼠60只隨機(jī)分為空白對照組、模型組、舒馬普坦組（6mg·kg－1·d－1）和正清風(fēng)痛寧低劑量組（100mg·kg－1·d－1）、正清風(fēng)痛寧中劑量組（150mg·kg－1·d－1）、正清風(fēng)痛寧高劑量組（200mg·kg－1·d－1），每組10只。采用皮下注射NTG制作大鼠偏頭痛模型。Wistar大鼠稱質(zhì)量后按10mg·kg－1皮下注射NTG，制作實驗性偏頭痛模型。模型制作判定標(biāo)準(zhǔn)：模型制作后通過耳紅、撓頭、爬籠和煩躁不安等行為癥狀判定模型制作是否成功。成功的標(biāo)準(zhǔn)為模型動物精神不振，眼睛瞇成線狀，體溫明顯下降，蜷縮少動，肛門處有糞便堆積，體質(zhì)量逐日下降。本實驗中，除空白對照組外，其余各組動物造模后6～10min均出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、擺頭、爬籠次數(shù)增多和煩躁不安現(xiàn)象。模型組大鼠上述現(xiàn)象持續(xù)1～3h，繼而出現(xiàn)蜷臥，活動減少狀態(tài)。造模30min后按組分別灌服舒馬普坦、各劑量正清風(fēng)痛寧，模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。舒馬普坦和各劑量正清風(fēng)痛寧組大鼠在給藥后上述現(xiàn)象逐漸消失，趨于正常。

1.3 取材和標(biāo)本處理 造模4h后將大鼠用10%水合氯醛（0.30mL·100g－1）腹腔注射法進(jìn)行全身麻醉后，仰臥固定，開胸從左心室至主動脈插管，剪開右心耳，首先迅速灌注無菌生理鹽水200mL，然后灌注4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液200mL，灌注后斷頭，取出整個完整腦組織，4℃、4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液浸泡后，去除硬腦膜、大腦，保留腦干、軟腦膜和蛛網(wǎng)膜，在4%PFA磷酸鹽緩沖液中固定24h，然后放入20%蔗糖－PBS液中，至組織塊下沉。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片，常規(guī)HE染色。

1.4 計數(shù)蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù) 切片HE染色，奧林巴斯顯微鏡下觀察每張切片腦干蛛網(wǎng)膜下腔炎的炎癥反應(yīng)，計數(shù)腦干蛛網(wǎng)膜下腔40倍視野單位面積（以視野為單位）炎性細(xì)胞數(shù)總數(shù)。全部標(biāo)本的切片均由2名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師觀察復(fù)核。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結(jié)構(gòu)未被破壞，采用免疫組織化學(xué)方法檢測TNF－α和IL－1β表達(dá)情況。奧林巴斯顯微鏡下觀察每張切片左上、右上、左下、右下和中央部5個視野40倍圖片，計數(shù)每個視野TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞總數(shù)，取均值。全部標(biāo)本的切片均由2名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師觀察復(fù)核。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)及蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)顯微鏡下免疫組織化學(xué)染色陽性部位為細(xì)胞質(zhì)染為棕黃色，細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染為藍(lán)色。與空白對照組比較，模型組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，正清風(fēng)痛寧中、高劑量組和舒馬普坦組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1和圖2（插頁六）。

2.2 各組大鼠腦干蛛網(wǎng)膜下腔炎性反應(yīng) 空白對照組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔血管正常，無血管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠腦干蛛網(wǎng)膜下腔血管明顯擴(kuò)張充血，炎性細(xì)胞（以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞為主）浸潤，炎性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；正清風(fēng)痛寧低、中、高劑量組及舒馬普坦組炎性反應(yīng)減輕，炎性細(xì)胞數(shù)（以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主）明顯減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)Tab.1 Number of TNF－αand IL－1βexpression positive cells in brainstem of rats in various groups（n＝10，）

表1 各組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)Tab.1 Number of TNF－αand IL－1βexpression positive cells in brainstem of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with blank control group；△P＜0.05 compared with model group.

0 2.90±0.745.70±2.31 Model 0 15.20±5.53＊19.20±4.69＊Sumatriptan 6 1.80±0.79△2.80±1.40△Zhengqingfengtongning Low dose 10010.10±2.6013.50±4.30 Middle dose 150 6.90±1.45△7.70±1.50△High dose 200 6.00±2.21△7.00±1.33 ositive cells Blank control Group Dose（mg·kg－1）Number of TNF－α positive cells Number of IL－1β p△

表2 各組大鼠腦干蛛網(wǎng)下腔炎細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of inflammatory cells in brainstem subarachnoid space of rats in various groups（n＝10，）

表2 各組大鼠腦干蛛網(wǎng)下腔炎細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of inflammatory cells in brainstem subarachnoid space of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with blank control group；△P＜0.01 compared with model group.

0 1.90±0.74 Model 0 28.33±2.06＊Sumatriptan 6 11.00±1.05△Zhengqingfengtongning Low dose 100 9.10±1.10△Middle dose 150 5.60±0.97△High dose 200 2.60±0.84 ace Blank control Group Dose（mg·kg－1）Number of inflammatory cells of per unit area subarachnoid sp△

3 討 論

偏頭痛是一種原發(fā)性頭痛，是臨床常見病、多發(fā)病，其影響、困擾著全球總?cè)丝?0%的人群，特別是20～50歲的女性［3］，年患病率女性為3.3%～32.6%，男性為0.70%～16.1%［4］。偏頭痛不但是神經(jīng)科常見病，還是腦血管病的危險因素之一，與神經(jīng)科許多疾病共患病，如焦慮癥、抑郁癥和癲癇等，但其發(fā)病機(jī)制目前尚無定論。三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說為目前的主流學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為：三叉神經(jīng)受損害、神經(jīng)纖維受刺激導(dǎo)致腦膜ANI發(fā)生，誘發(fā)偏頭痛。三叉神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肽和炎性介質(zhì)在偏頭痛病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用［2］。細(xì)胞因子是重要的炎性介質(zhì)之一，是炎性通路上的重要調(diào)質(zhì)，與偏頭痛發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)；細(xì)胞因子及其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)所有細(xì)胞類型、包括神經(jīng)細(xì)胞中均表達(dá)［5］。細(xì)胞因子不僅在健康人大腦中產(chǎn)生，參與正常神經(jīng)功能，而且在神經(jīng)源性炎癥中起作用，是神經(jīng)源性炎癥調(diào)質(zhì)，誘導(dǎo)疼痛［6］，TNF－a和IL－1能夠引起強(qiáng)烈的痛覺過敏［5］。有報道［6］顯示：在偏頭痛患者偏頭痛發(fā)作期，血漿TNF－α水平升高。IL－1在偏頭痛患者中也被證實升高［7］。促炎性細(xì)胞因子TNF－α和IL－1β在調(diào)節(jié)疼痛中起到關(guān)鍵性作用，其有助于三叉神經(jīng)纖維致敏［7］。在人體臨床試驗中TNF－α能夠引起頭痛，TNF－α抗體能減少疼痛。本實驗通過皮下注射NTG復(fù)制偏頭痛模型。注射NTG可引起大鼠硬腦膜遲發(fā)性炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子IL－1β和IL－6產(chǎn)生。本實驗結(jié)果與前述的研究結(jié)果一致，TNF－α和IL－1β在模型組大鼠腦干中表達(dá)水平明顯升高。此外，本文作者的前期實驗［8］結(jié)果和本實驗觀察結(jié)果與何秋等［9］觀察的結(jié)果一致：模型組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，空白對照組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔無明顯炎性反應(yīng)。三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說認(rèn)為：由于某種因素激活了腦膜血管周圍的三叉神經(jīng)末梢，釋放某些神經(jīng)肽，使腦膜血管舒張，產(chǎn)生ANI。ANI反應(yīng)刺激中樞和三叉神經(jīng)末梢釋放化學(xué)物質(zhì)或炎癥介質(zhì)，引起血管舒張、滲漏，造成疼痛的延長［10－12］，此過程包括神經(jīng)源性炎癥、中樞痛覺致敏等偏頭痛病理生理過程。神經(jīng)源性炎癥是偏頭痛疼痛產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實驗結(jié)果證實：偏頭痛模型大鼠存在ANI反應(yīng)，蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞增多和中樞促炎性細(xì)胞因子表達(dá)增多。

正清風(fēng)痛寧主要成分是鹽酸青藤堿，是從中藥青風(fēng)藤中提取的單體生物堿，具有明顯抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)咳等藥理作用。梁瑞燕等［13］通過體外實驗研究表明：青藤堿對IL－1β基因表達(dá)有較強(qiáng)的抑制作用，并認(rèn)為青藤堿可能是通過抑制炎癥性細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其抗炎作用。另有研究［14］證實：青藤堿可通過抑制炎性細(xì)胞因子如IL－1β、IL－2、IL－8和TNF－α等的表達(dá)及合成而產(chǎn)生抗炎作用；青藤堿還能有效抑制巨噬細(xì)胞釋放IL－1及TNF－α，從而有效抑制了新一輪炎癥的啟動［15］。

綜上所述，青藤堿可抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和合成，從而減少炎性細(xì)胞因子所致的疼痛。曲普坦類藥物是一類特異性5－HT1B／1D受體激動劑，包括舒馬普坦等，是偏頭痛急性發(fā)作期的主要治療藥物。曲坦類藥物治療偏頭痛可能的機(jī)制：收縮已擴(kuò)張的腦血管，減少神經(jīng)肽、蛋白及血漿滲出，減少偏頭痛的血管炎癥反應(yīng)，阻斷疼痛在三叉神經(jīng)系統(tǒng)傳遞，抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)致敏中樞［16－19］。這些反應(yīng)均是偏頭痛疼痛發(fā)作的特征性特點。舒馬曲坦是第1個人工合成的選擇性5－HT（5－HT1B／1D）受體激動劑，其治療偏頭痛發(fā)作的作用機(jī)制：收縮特定的顱內(nèi)血管，抑制激活突觸前膜的5－HT受體，抑制活化的三叉神經(jīng)元放神經(jīng)遞質(zhì)和炎癥介質(zhì)［20－21］。本實驗結(jié)果顯示：NTG可引起模型組大鼠腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)及其蛛網(wǎng)膜下腔炎性反應(yīng)明顯增多，舒馬普坦組和各劑量正清風(fēng)痛寧組大鼠上述反應(yīng)明顯減輕，但舒馬普坦組與各劑量正清風(fēng)痛寧比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，各劑量正清風(fēng)痛寧組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞數(shù)比舒馬普坦組減少更明顯，且高劑量組與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，舒馬普坦抑制腦干中TNF－α和IL－1β表達(dá)明顯優(yōu)于正清風(fēng)痛寧組。本文作者推測：正清風(fēng)痛寧有抑制實驗性偏頭痛模型大鼠ANI反應(yīng)的作用，從而達(dá)到其在治療偏頭痛中的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。有研究［22－23］證實：神經(jīng)源性炎癥發(fā)生在人類偏頭痛中，但這一直是一個有爭議的領(lǐng)域。因此，需要更多的實驗數(shù)據(jù)來進(jìn)一步證實上述實驗結(jié)果。

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