鄭文娟 杜一超 林 潔 蔣晨華 丁沃娜 朱世華

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基于線粒體DNA D-loop區(qū)部分序列分析舟山海域帶魚種群遺傳結(jié)構(gòu)

鄭文娟 杜一超 林 潔 蔣晨華 丁沃娜 朱世華

(寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 寧波 315212)

帶魚; 線粒體DNA; D-loop區(qū); 遺傳多樣性; 舟山

帶魚(Linnaeus), 俗稱刀魚、白帶魚, 隸屬鱸形目(Perciformes), 帶魚科(Trichiuridae), 帶魚屬(), 廣泛分布于世界各溫?zé)釒ШＳ? 在我國主要分布在東海、南海、黃海和渤海[1]。帶魚為我國最重要的捕撈對(duì)象, 其產(chǎn)量多年來一直位居我國海洋捕撈魚類產(chǎn)量的首位, 占有十分重要的漁業(yè)經(jīng)濟(jì)地位。舟山帶魚是全國首批海鮮類地理標(biāo)志證明商標(biāo)海鮮, 曾與大黃魚、小黃魚、墨魚并稱為我國“四大漁業(yè)”。自20世紀(jì)70年代后, 由于受過度捕撈和環(huán)境變化等影響, 舟山海域的帶魚資源出現(xiàn)了嚴(yán)重衰退; 1989年起我國在東海區(qū)實(shí)施了帶魚主要產(chǎn)卵場5—6月禁捕制度和1995年起實(shí)施伏季休漁漁業(yè)管理, 經(jīng)過10多年較為有效地實(shí)施, 帶魚的年平均資源量有較大的增長, 漁獲質(zhì)量也有很大的改善。但在當(dāng)今巨大的捕撈壓力下, 帶魚種群組成小型化、性成熟提早、單位漁獲量下降等生長型過度捕撈現(xiàn)象還比較明顯, 帶魚資源仍處于緩慢衰退之中[2]。

目前, 國內(nèi)對(duì)帶魚的研究主要集中于其生物學(xué)特征、年齡與生長、攝食習(xí)性、漁業(yè)資源等幾個(gè)方面[3—6], 對(duì)帶魚的遺傳多樣性研究較少, 國內(nèi)一些學(xué)者已應(yīng)用RAPD、16S rRNA[7]、同工酶[8]、D-loop區(qū)[9]和COI[10]等技術(shù)對(duì)不同海域的帶魚種群進(jìn)行分析, 而對(duì)舟山海域帶魚種群遺傳多樣性的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。線粒體DNA D-loop區(qū)序列由于不編碼蛋白質(zhì)而不受自然選擇的影響, 因而進(jìn)化速率最快, 積累了較多的突變, 如堿基替換、插入、缺失, 以及眾多的串聯(lián)重復(fù)序列等, 所以在種群遺傳學(xué)分析中得到普遍應(yīng)用[11, 12]。本研究擬通過對(duì)舟山海域帶魚的線粒體DNA D-loop區(qū)部分序列的測定, 來探討其種群遺傳結(jié)構(gòu), 為今后長期可持續(xù)利用和保護(hù)帶魚資源奠定良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

帶魚樣本于2013年的4月、5月、7月隨機(jī)采集于舟山金塘、沈家門、定海的3條漁船, 試驗(yàn)魚取其肌肉組織, 用95%酒精固定, 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存于–20℃。

1.2 方法

基因組DNA提取從保存的樣本中隨機(jī)抽取54個(gè)樣本, 3批樣本標(biāo)號(hào)為: D1-01至D1-18(種群1, 4月采自金塘), D2-01至D2-19(種群2, 5月采自沈家門), D3-01至D3-17(種群3, 7月采自定海)。基因組DNA從保存于95%酒精的肌肉樣品中提取, 參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的酚/ 氯仿抽提法[13], 提取并純化帶魚基因組DNA, 經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證提取的基因組DNA是否斷裂和降解, 用Nanodrop 2000測DNA的濃度和質(zhì)量, 保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增從GenBank下載帶魚線粒體DNA 全長(Genbank No: NC_011719)序列, 用Oligo軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增帶魚線粒體DNA控制區(qū)部分序列的引物如下: DLF490: 5￠-ATACCAGGACTCAACATCTCT-3￠; DLR996: 5￠-TTTG CAGGACCATAAGTAAC-3￠。PCR反應(yīng)體系為25 μL: Buffer緩沖液(含Mg2+)2.5 μL, dNTPs (10 mol/L) 0.5 μL,酶0.5 μL, 上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL, 模板DNA (約為100 ng) 1 μL, 滅菌蒸餾水19.5 μL。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性4min; 94℃變性30s, 52℃退火30s, 72 ℃延伸45s, 34個(gè)循環(huán); 72℃延伸15min; 反應(yīng)設(shè)立不含DNA模板的空白對(duì)照, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

PCR產(chǎn)物電泳割膠回收, 用凝膠純化試劑盒(上海生工)純化, 與pUCm-T載體(上海生工)連接, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α, 篩選陽性克隆子, 擴(kuò)大培養(yǎng)后用質(zhì)粒抽提試劑盒(上海生工)提取質(zhì)粒, 用M13引物在自動(dòng)測序儀(Applied Biosystems 3730, 上海英俊)正反雙向測序, 以保證所測序列的準(zhǔn)確性。

數(shù)據(jù)處理經(jīng)NCBI網(wǎng)站blast驗(yàn)證所得的帶魚線粒體DNA控制區(qū)部分序列, 應(yīng)用Clustal X1.8軟件進(jìn)行多重序列的比對(duì), 并輔以人工校正; 用MEGA5.0軟件統(tǒng)計(jì)堿基組成, 轉(zhuǎn)換顛換比(Ts/Tv)及應(yīng)用Kimura雙參數(shù)法計(jì)算遺傳距離[14], 并用該軟件的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建帶魚單倍型系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹, 以南海帶魚()(Genbank No: NC_018791)為外類群, 以Kimura雙參數(shù)法為替代模型, 系統(tǒng)樹分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis, BP)重復(fù)檢測1 000次。利用DnaSP4.0軟件統(tǒng)計(jì)單倍型及多態(tài)位點(diǎn)()、計(jì)算單倍型多樣性(d), 平均核苷酸差異數(shù)()及核苷酸多樣性()。用Arlequin 3.11軟件[15]計(jì)算Tajima’s和Fu’ss值(1000次重復(fù)隨機(jī)抽樣重排后進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)), 并進(jìn)行核苷酸不配對(duì)分布(Mismatch distribution), 并獲得值, 來檢測舟山帶魚種群的歷史動(dòng)態(tài)。群體歷史擴(kuò)張時(shí)間用參數(shù)=2進(jìn)行估算[16], 其中是擴(kuò)張時(shí)間參數(shù);=2,為變異速率,表示序列長度;表示自擴(kuò)張以來所經(jīng)歷的代數(shù); 擴(kuò)張時(shí)間=×代時(shí), 代時(shí)由研究對(duì)象的性成熟年齡決定。在本研究中, 世代時(shí)間設(shè)置為1年[3], 控制區(qū)分化速率分別采用3%—10%/MY (Million year)[17]。

2 結(jié)果

2.1 舟山帶魚種群的mtDNA控制區(qū)堿基組成

本實(shí)驗(yàn)帶魚種群mtDNA D-loop區(qū)域部分序列上傳至GenBank, 序列號(hào)為KP689433-kp689486。54個(gè)帶魚個(gè)體的mtDNA 控制區(qū)部分序列長度介于525—527 bp, 堿基長度基本保持一致。T、C、A、G這4種堿基的平均含量分別為31.7%、22.0%、26.8%和19.5%, 其中A+T (58.5%)的含量高于G+C (41.5%)的含量, 這個(gè)現(xiàn)象與其他魚類的控制區(qū)的堿基含量相似。

2.2 舟山帶魚種群的mtDNA控制區(qū)序列多態(tài)性

在54個(gè)舟山帶魚的mtDNA 控制區(qū)部分序列中, 共發(fā)現(xiàn)58個(gè)變異位點(diǎn), 占分析位點(diǎn)總數(shù)的11.0%, 2個(gè)插入或缺失位點(diǎn), 其中單一突變位點(diǎn)有26處, 兩核苷酸間變異的突變位點(diǎn)有25處, 三核苷酸間的變異有1處; 其他32處均為簡約信息位點(diǎn), 其突變位點(diǎn)為兩核苷酸間的變異有27處, 三核苷酸間的變異有5處, 所有的突變位點(diǎn)均為兩核苷酸或三核苷酸間的變異, 并未發(fā)現(xiàn)四核苷酸間的變異; 轉(zhuǎn)換/顛換平均值為3.935。帶魚個(gè)體間遺傳距離為0.000—0.038, 平均遺傳距離()為0.012。3個(gè)地理種群內(nèi)的平均遺傳距離: 種群1為0.013, 種群2為0.014, 種群3為0.010; 種群間的平均遺傳距離: 種群1與種群2為0.014, 種群1與種群3為0.012, 種群2與種群3為0.012, 種群內(nèi)與種群間的遺傳距離相差很小。同時(shí)3個(gè)種群間的ST值都很小, 且種群1和種群2間的ST值為–0.009, 種群1和種群3間為–0.002, 都是負(fù)數(shù), 種群2和種群3間的ST值為0.009, 說明種群間存在較大的基因流, 遺傳分化不明顯。54個(gè)帶魚個(gè)體中共檢測出45個(gè)單倍型, 其中D1-02和D3-17, D2-19、D3-11和D3-13, D2-04、D2-15和D2-18, D1-15和D2-05, D2-08和D3-15, D1-11、D3-02和D3-06之間共享單倍型, 單倍型多樣性(d)為0.991, 核苷酸多樣性()為0.012, 平均核苷酸差異數(shù)()為6.441。

2.3 舟山帶魚種群遺傳結(jié)構(gòu)

根據(jù)mtDNA D-loop區(qū)部分序列, 以南海帶魚為外群, 用MEGA 5.0構(gòu)建了54個(gè)帶魚個(gè)體的NJ樹見圖1。枝上的數(shù)值是1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的置信度值(僅顯示支持率大于50%的數(shù)據(jù))。根據(jù)圖1所示, 共享單倍型的個(gè)體間都聚成一支, 3個(gè)種群內(nèi)的個(gè)體間并沒有明顯的聚簇現(xiàn)象出現(xiàn), 種群間互相散布交叉現(xiàn)象比較普遍, 這個(gè)結(jié)果與種群內(nèi)與種群間的遺傳距離相差微小和種群間的分化指數(shù)ST低相符。

2.4 舟山帶魚種群歷史動(dòng)態(tài)

根據(jù)Tajima’s和Fu’ss值中性檢驗(yàn)以及舟山帶魚群體堿基錯(cuò)配分布曲線是否呈現(xiàn)多峰或單峰型來判定舟山帶魚種群在過去是否發(fā)生了群體擴(kuò)張。結(jié)果顯示, Tajima’s值為-1.701 (=0.012<0.05), Fu’ss=-25.109 (=0.000<0.05), 同時(shí)根據(jù)線粒體DNA D-loop區(qū)部分序列多態(tài)性, 舟山帶魚種群的單倍型核苷酸不配對(duì)分布曲線為明顯的單峰泊松分布, 并且與群體擴(kuò)張模型下的預(yù)期分布相吻合(圖2), 結(jié)合三者說明舟山帶魚種群可能經(jīng)過群體擴(kuò)張。在本研究中,=5.197,=527, 代時(shí)取1, 計(jì)算得到值為0.082—0.025 MY, 說明帶魚種群擴(kuò)張時(shí)間約為更新世晚期(冰河期)。

3 討論

近年來, 由于過度捕撈和沿海水體遭受污染等因素, 我國許多海洋經(jīng)濟(jì)魚類資源面臨著衰退, 除直觀看得到的單位漁獲量下降、低齡化、小型化、性成熟提早等現(xiàn)象, 物種的遺傳多樣性也都在逐漸降低[18—20]。從遺傳學(xué)和進(jìn)化角度看, 物種的遺傳多樣性降低可能導(dǎo)致物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和生存能力降低, 物種退化, 極端情況下甚至威脅物種生存。

3.1 舟山帶魚種群遺傳多樣性

本研究采用的是帶魚mtDNA D-loop區(qū)的部分序列, 去除了終止序列區(qū)(Termination associated sequence)和保守序列區(qū)(Conserved sequence blocks)的后續(xù)序列, 這是因?yàn)楦鶕?jù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)在帶魚的終止序列區(qū)(TAS)有6—7個(gè)57 bp的重復(fù)序列, 以及保守序列區(qū)(CSB)的后續(xù)序列中有2—3個(gè)12 bp的重復(fù)序列[21], 因此如果擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)全序列, 會(huì)因?yàn)橹貜?fù)序列的個(gè)數(shù)差異導(dǎo)致整個(gè)群體遺傳多樣性的結(jié)果會(huì)偏高。

本研究通過對(duì)舟山海域帶魚線粒體DNA D-loop區(qū)部分序列的測定, 發(fā)現(xiàn)54個(gè)個(gè)體中共檢測到58個(gè)多態(tài)位點(diǎn), 44個(gè)單倍型, 單倍型多樣性(d)為0.991, 核苷酸多樣性()為0.012, 平均遺傳距離()為0.012, 平均核苷酸差異數(shù)()為6.441。相比2003年, 蒙子寧等采用mtDNA 16S rRNA分子標(biāo)記對(duì)黃海帶魚(=12)進(jìn)行DNA多態(tài)性分析, 結(jié)果表明, 12個(gè)個(gè)體只有3個(gè)單倍型, 單倍型多樣性(d為0.25, 平均遺傳距離()為0.001[7]; 2013年李鵬飛等[10]利用mtDNAⅠ序列對(duì)浙江近海水域帶魚群體(=15)進(jìn)行分析得出: 15個(gè)序列檢測到10個(gè)單倍型, 核苷酸多樣性為0.00513, 平均核苷酸差異數(shù)為3.124; 以上兩研究相比本實(shí)驗(yàn)單倍型多樣性、平均遺傳距離和核苷酸多樣性指數(shù)均要低, 這是因?yàn)閙tDNA 16S rRNA和Ⅰ相對(duì)D-loop區(qū)較保守, 其次是兩研究的實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)不多。2011年, 肖永雙采用D-loop區(qū)部分序列(556 bp)對(duì)3個(gè)地理群體[北海(=14)、溫州(=20)、南海(=20)]的帶魚進(jìn)行遺傳多樣性研究, 結(jié)果顯示, 54個(gè)個(gè)體共檢測到40種單倍型, 3個(gè)地理群體單倍型多樣性(d)指數(shù)也都較高, 依次為從0.97± 0.04、0.99±0.02、0.98±0.02, 平均核苷酸差異數(shù)() 依次為4.66±2.43、4.87±2.48、4.65±2.38[9], 以上分析數(shù)據(jù)和本實(shí)驗(yàn)相差無幾, 這也綜合體現(xiàn)了國內(nèi)各個(gè)海域的帶魚的遺傳變異基本處于同一水平。

目前已運(yùn)用線粒體DNA D-loop區(qū)對(duì)舟山海域的刀鱭()[22]、鰳魚()[23]、褐牙鲆()[24]、灰鯧()[25]、大黃魚()[19]、小黃魚()[20]等6種魚類的種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析, 其中單倍型間的核苷酸多樣性()、平均遺傳距離()、單倍型多樣性(d)是衡量一個(gè)種群mtDNA遺傳變異的重要指標(biāo)[26]。2008年, 楊金權(quán)等[22]研究發(fā)現(xiàn)舟山海域的7個(gè)刀鱭樣本的平均單倍型多樣性(d)為1.0000, 平均核苷酸多樣性()為0.0089; 2010年, 毛勇等[19]對(duì)舟山岱衢族大黃魚群體23個(gè)個(gè)體進(jìn)行分析, 結(jié)果表明, 平均單倍型多樣性(d)只有0.087, 核苷酸多樣性()為0.00056, 遺傳距離值為0.00058; 2012年鄭文娟等對(duì)舟山小黃魚群體53個(gè)個(gè)體遺傳多樣性分析所得: 單倍型多樣性(d)為0.9993, 單倍型間的平均遺傳距離為0.012, 核苷酸多樣性()為0.01233[20]; 以上研究結(jié)果再加Grant & Bowen綜述各種海洋魚類的線粒體DNA單倍型多樣性(d)為0.11—1.00, 核苷酸多樣性()為0.0008—0.0320[27], 就單倍型多樣性(d)而言, 舟山帶魚處于較高水平; 但結(jié)合帶魚種群的平均遺傳距離()以及核苷酸多樣性()就會(huì)發(fā)現(xiàn), 舟山帶魚的遺傳多樣性還只處于中等水平。

3.2 舟山帶魚種群遺傳結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)采自舟山金塘、沈家門、定海的3個(gè)種群內(nèi)平均遺傳距離分別為: 0.013、0.014、0.010, 同時(shí)3個(gè)種群間的平均遺傳距離在0.012—0.014, 種群內(nèi)與種群間的遺傳距離相差很小, 這也在一定層面上表明目前舟山海域帶魚種群的遺傳多樣性水平。Shaklee等[28]提出魚類在屬、種和種群三級(jí)水平上的遺傳距離值分別為0.90、0.30及0.05, 本研究明顯比Shaklee等提出的數(shù)據(jù)低, 3個(gè)舟山地理種群間遠(yuǎn)未達(dá)到種群分化標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)MEGA 5.0構(gòu)建了54個(gè)帶魚個(gè)體的NJ樹也發(fā)現(xiàn), 3個(gè)種群間的個(gè)體互相穿插, 并未形成各自種群內(nèi)特定一支。同時(shí)st結(jié)果也顯示3個(gè)帶魚種群間存在負(fù)值現(xiàn)象, 表明種群內(nèi)個(gè)體間的差異大于種群間的差異水平, 表明舟山海域各區(qū)域間不存在顯著的遺傳分化, 區(qū)域間是隨機(jī)交配的。這是因?yàn)闁|海帶魚在越冬、生殖、索餌等階段進(jìn)行洄游, 主要屬南北往返性質(zhì), 也有東南-西北向洄游規(guī)律。主要越冬場在浙江東南部外海、福建近外海和臺(tái)灣海峽沿岸一帶, 春季進(jìn)行生殖和索餌洄游, 魚群向北移動(dòng), 北界可達(dá)東海北部海域, 秋末開始進(jìn)行越冬往南洄游。東海帶魚在洄游過程中, 相互交匯在一起, 具有較強(qiáng)的擴(kuò)散潛力, 所以群體間不會(huì)出現(xiàn)顯著的遺傳分化, 這和劉子藩等的結(jié)論(東海帶魚, 不論近海或外海的群體系同一個(gè)種群)相一致[29]。同樣肖永雙對(duì)北海、溫州和南海的進(jìn)行遺傳分化發(fā)現(xiàn)這3個(gè)種群各自所屬的單倍體也相互交叉, 未與采樣地點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的同一分支[9]。

若Tajima’s值顯著偏離中性檢驗(yàn), 而且核苷酸錯(cuò)配曲線呈現(xiàn)單峰分布, 則表明群體在過去經(jīng)受了擴(kuò)張, 反之, 群體保持穩(wěn)定[30]。本研究結(jié)果顯示Tajima’s值為–1.701 (=0.012<0.05), 帶魚線粒體DNA D-loop區(qū)的單倍型核苷酸不配對(duì)分布基本表現(xiàn)出明顯的單峰泊松分布, 同時(shí)群體擴(kuò)張通常產(chǎn)生絕對(duì)值較大的負(fù)的s值[31], 帶魚種群的Fu’ss=-25.109 (=0.000<0.05), 這說明舟山帶魚群體確實(shí)經(jīng)歷了群體擴(kuò)張。通過計(jì)算值我們估計(jì)帶魚種群擴(kuò)張時(shí)期約在8.2萬至2.5萬年前, 處于冰河期。因?yàn)榈谒募o(jì)末期的更新世晚期有幾次冰期與間冰期旋回, 曾引起海平面的升降, 現(xiàn)生海洋物種的分布及種群遺傳結(jié)構(gòu)大多受到這種冰期旋回的影響。牛素芳等研究認(rèn)為, 更新世后的海平面上升事件對(duì)東海魚類的mtDNA遺傳結(jié)構(gòu)具有重要影響[32], 如高眼鰈()、斯氏美首鰈()、長鰈()[9]、小黃魚[20]、竹莢魚()[32]等都在更新世冰期進(jìn)行了群體擴(kuò)張, 這也使得我國近海這些魚類群體間遺傳差異不顯著。

3.3 展望

東海區(qū)海域是帶魚良好的產(chǎn)卵場與索餌場, 以舟山和嵊泗漁場最為著名, 而且舟山帶魚是全國首批海鮮類地理標(biāo)志證明商標(biāo)海鮮, 具有較高的海洋漁業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。從1995年實(shí)施伏季休漁漁業(yè)管理, 經(jīng)過10多年較為有效地實(shí)施, 東海區(qū)帶魚的年漁獲量開始出現(xiàn)了持續(xù)增加之勢(shì), 但每年伏季休漁結(jié)束開捕后, 在強(qiáng)大的捕撈壓力下, 難于釋放幼魚群體, 到冬季時(shí), 親體的殘存數(shù)量大幅減少, 以致其群體結(jié)構(gòu)仍處于小型化、低齡化, 漁獲質(zhì)量未能得到根本地改善。結(jié)合本研究中舟山帶魚種群的遺傳多樣性只處于中低水平來看, 必須采取更科學(xué)、更嚴(yán)格的管理措施。農(nóng)業(yè)部于2008年12月公布了東海帶魚國家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū), 2010年正式啟動(dòng), 2013年浙江省海洋與漁業(yè)局發(fā)布《浙江省2013年海洋禁漁通告》, 首次規(guī)定東海帶魚保護(hù)區(qū)核心區(qū)將實(shí)行禁漁。該保護(hù)區(qū)位于浙江沿岸中北部海域, 跨舟山漁場和魚山漁場, 總面積約2.2′104km2, 不僅是我國沿海最大的水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)之一, 也是東海帶魚最重要的產(chǎn)卵場、索餌場和洄游通道等主要的生長繁育區(qū)域, 這將為帶魚資源的利用和保護(hù)提供有利的平臺(tái), 如此期望帶魚資源走向可持續(xù)發(fā)展的道路。

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GENETIC DIVERSITY ANALYSIS OFIN ZHOUSHANBASED ON MITOCHONDRIAL DNA D-LOOP REGION PARTIAL SEQUENCES

ZHENG Wen-Juan, DU Yi-Chao, LIN Jie, JIANG Chen-Hua, DING Wo-Na and ZHU Shi-Hua

(College of Science & Technology, Ningbo University, Ningbo 315212, China)

; Mitochondrial DNA; D-loop region; Genetic diversity; Zhoushan

10.7541/2015.53

Q349+.1

A

1000-3207(2015)02-0408-06

2014-05-15;

2014-11-18

浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目(Y201430356); 寧波大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(XYL14030)資助

鄭文娟(1982—), 女, 浙江湖州人; 研究生, 助理研究員; 主要從事水產(chǎn)資源研究。E-mail: zhengwenjuan@nbu.edu.cn

朱世華(1963—), E-mail: zhushihua@nbu.edu.cn