郭湘云，李 華，鄭風(fēng)榮，王 波，徐宗軍，丁倩倩，趙 盟，李 青

（1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連116023；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266000）

神經(jīng)肽Y（Neuropeptide Y，NPY）是由瑞典科學(xué)家Tatenoto K［1］于1982年首次從豬腦組織中得到的一種單鏈多肽，在結(jié)構(gòu)上，與酪酪肽（Peptide Tyrosine Tyrosine，PYY）和胰多肽（Polypeptide，PP）十分相似，故認(rèn)為同屬胰多肽家族［2－3］。NPY基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，成熟活性肽由36個(gè)氨基酸組成，迄今為止，所研究的脊椎動(dòng)物發(fā)現(xiàn)都含有NPY基因，并且物種之間的NPY保持高度同源性［4－5］。在魚(yú)類的食欲調(diào)控因子中，NPY被認(rèn)為是調(diào)控?cái)z食最為關(guān)鍵的因子，而且NPY已經(jīng)被證實(shí)對(duì)攝食有明顯的促進(jìn)作用，如金魚(yú)、草魚(yú)等［6－9］。但關(guān)于NPY與星斑川鰈攝食的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

星斑川鰈（Platichthysstellatus）隸屬硬骨魚(yú)綱（Osleichthyes），鰈形目（Pleuronectiformes），鰈科（Pleuronectidae），川鰈屬（Platichthys），分布于我國(guó)黃海中北部海區(qū)沿岸，星斑川鰈繁殖力強(qiáng)，性情溫馴，適宜于進(jìn)行集約化養(yǎng)殖，是重要的新型海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類。目前關(guān)于調(diào)節(jié)星斑川鰈攝食的研究多數(shù)是調(diào)整飼養(yǎng)結(jié)構(gòu)及養(yǎng)殖環(huán)境等方面因素，很少有從分子水平上研究星斑川鰈食欲與調(diào)控機(jī)理及其影響因子，從而揭示其攝食調(diào)控和能量代謝關(guān)系的研究。本實(shí)驗(yàn)以星斑川鰈為材料，克隆了星斑川鰈神經(jīng)肽NPY基因cDNA序列，并利用Real－time PCR檢測(cè)了NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的分布情況，并研究了饑餓對(duì)NPY在腦組織表達(dá)的影響，從而為進(jìn)一步研究NPY在促進(jìn)星斑川鰈攝食方面的分子機(jī)制而建立一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

星斑川鰈取自日照海洋水產(chǎn)資源增殖站，健康養(yǎng)殖魚(yú)共60尾，采樣時(shí)間為2013－10，體表完好，長(zhǎng)約15 cm，重約200g。解剖取魚(yú)的腦組織立即存放于液氮中，備用。

1.2 RNA提取

取正常健康的星斑川鰈的腦組織，采用TRIZOL Reagent（康為世紀(jì)）提取總RNA，使用RNase Free DNaseⅠ（TaKaRa）對(duì)總RNA進(jìn)行處理以除去DNA污染，最終定容于無(wú)RNase水。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定OD260／OD280比值以檢測(cè)RNA純度并計(jì)算濃度，同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。純化后的總RNA溶液保存于－80℃。

1.3 NPY cDNA的5′RACE和3′RACE

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的星斑川鰈腦組織的轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中的NPY部分序列，利用Primers 5.0設(shè)計(jì)引物GSP2、GSP1（表1），以通用引物UPM（universal primer）作為上、下游引物擴(kuò)增目的片段，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification試劑盒（Clontech）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、5′RACE擴(kuò)增和3′RACE擴(kuò)增。3′RACE程序?yàn)椋?5℃4min；95℃45s，63℃45s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。5′RACE程序?yàn)?5℃4min；95℃45s，65℃45s；72℃30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（生工生物工程有限公司）切膠回收5′RACE產(chǎn)物及3′RACE產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物純化后連接到PTZ57R／T（Thermo）載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.ColiDH5α中，涂平板、挑菌，經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆后進(jìn)行擴(kuò)培，采用試劑盒提取質(zhì)粒DNA（生工生物工程（上海）有限公司），送上海桑尼公司進(jìn)行測(cè)定序列，將5′RACE和3′RACE獲得的基因片段連接為NPY cDNA全長(zhǎng)，用引物NPY－F和NPY－R進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證，并與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 實(shí)驗(yàn)使用引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.4 生物信息學(xué)分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)；利用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接；用GENSCAN軟件確定正確的開(kāi)放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列；用ProtParam預(yù)測(cè)理化性質(zhì)；用PredictProtein預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)；用獲得的星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種神經(jīng)肽Y氨基酸序列進(jìn)行Clustal W比對(duì)，然后用 MEGA 5.0軟件 Neighbor－joining法（bootstrap values為1 000）進(jìn)行分子進(jìn)化分析；利用SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用I－TASSER軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.5 星斑川鰈NPY基因的組織表達(dá)及饑餓對(duì)其表達(dá)影響

采用Realtime PCR法檢測(cè)NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的相對(duì)表達(dá)量和在不同饑餓程度時(shí)腦組織中的表達(dá)水平變化。

取自日照市海洋水產(chǎn)資源增殖站的健康星斑川鰈50尾，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)5d，試驗(yàn)期間海水溫度保持在18℃左右，每天換水，充氧。共設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組，每處理組3組重復(fù)，每組重復(fù)5尾星斑川鰈，分別在0，24，72h饑餓時(shí)間在3組試驗(yàn)魚(yú)中取樣，每組隨機(jī)抽取5尾魚(yú)取其腦組織，使用Prime ScriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

根據(jù)得到的星斑川鰈NPY cDNA全序列，設(shè)計(jì)特異性引物Q－NPY F和Q－NPY R，以β－actin作為內(nèi)參引物（表1）。以各組織RNA和不同饑餓時(shí)間的腦組織RNA為模板，采用Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche）進(jìn)行Real－time PCR程序采用2步法，其中退火和延伸歸結(jié)為一步：95℃10 min；95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)。

內(nèi)參基因在各個(gè)組織中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)基因的表達(dá)水平變化時(shí)作為參照物，目的基因的CT值與內(nèi)參基因的CT值之間的差稱為ΔCT，處理組ΔCT與未處理組ΔCT之間的差為－ΔΔCT，2－ΔΔCT值即為樣品的該基因的相對(duì)表達(dá)水平，校準(zhǔn)樣品恒定為1。利用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），設(shè)定差異顯著水平P為0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)即差異顯著，當(dāng)P＜0.01時(shí)即差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 星斑川鰈NPY基因cDNA序列序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.1.1 星斑川鰈NPY基因cDNA序列序列分析

星斑川鰈NPY基因的核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列（圖1）。利用在線工具GENSCAN（http：∥genes.mit.edu／GENSCAN.html）分析得知：該cDNA全長(zhǎng)559bp，5′UTP含有13個(gè)堿基，3′UTP含有235個(gè)堿基，開(kāi)放閱讀框?yàn)?10bp，編碼69個(gè)氨基酸。

2.1.2 星斑川鰈NPY預(yù)測(cè)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線工具ProtParam（http：∥web.expasy.org）分析編碼的氨基酸，結(jié)果顯示其理論分子量為7.98 kDa，分子式為C355H559N95O112S1，總共有1 122個(gè)原子組成，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)（theoretical pI）為5.24，理論推測(cè)半衰期（estimated half－life）在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中為30h，不穩(wěn)定系數(shù)為85.57，可推斷為不穩(wěn)定蛋白，總帶正電殘基（Arg＋Lys）為9，總帶負(fù)電殘基（Asp＋Glu）為11，總平均親水性（grand average of hydropathicity）為－0.800，脂肪系數(shù)（aliphatic index）為83.48。

表2 星斑川鰈NPY氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of NPY in Platichthys stellatus

圖1 星斑川鰈NPY cDNA核酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of Neuropeptide Y fromPlatichthys stellatus

2.1.3 星斑川鰈NPY預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，在NPY蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α－螺旋（Alpha helix）占47.83%，β－轉(zhuǎn)角（Beta turn）占2.90%，無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil）占49.28%（圖2）。

圖2 SOPMA軟件對(duì)NPY蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.2 Secondary structure of Platichthys stellatus NPY protein analyzed by SOPMA

2.1.4 星斑川鰈NPY預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)I－TASSER軟件預(yù)測(cè)了星斑川鰈NPY蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 I－TASSER軟件對(duì)NPY蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果Fig.3 Tertiary structure of Platichthys stellatus NPYprotein analyzed by I－TASSER

2.2 星斑川鰈NPY氨基酸的同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2.1 星斑川鰈NPY氨基酸的同源性分析

將星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種的NPY氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明：星斑川鰈NPY與美國(guó)黃蓋鰈（Pseudopleuronectesamericanus）的同源性最高，為100%；與鱸形目花鱸（Lateolabrax japonicus）、鰤?mèng)~（Seriolaquinqueradiata）、點(diǎn)帶石斑 魚(yú)（Epinepheluscoioides）、軍 曹 魚(yú)（Rachycentron canadum）、黑鯛（Acanthopagrusschlegeli）的同源性分別為99%，97%，97%，97%，97%（圖4）。

圖4 星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他物種NPY氨基酸序列的比較Fig.4 Amino acid sequence aligenment of NPY fromPlatichthys stellatus with other fishes

2.2.2 星斑川鰈NPY系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)MEGA5.0軟件構(gòu)建了星斑川鰈NPY cDNA和氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明：星斑川鰈NPY與鰈形目魚(yú)類的親緣關(guān)系較近，與美洲擬鰈聚為一支，這與上述Blast的分析結(jié)果一致（圖5，圖6）。

圖5 星斑川鰈NPY cDNA序列與其他脊椎動(dòng)物的NPY系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on the cDNA sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

圖6 星斑川鰈NPY氨基酸序列與其他脊椎動(dòng)物的NPY系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

2.3 星斑川鰈NPY mRNA的組織分布分析

采用Real time PCR法，以β－actin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)NPY mRNA在星斑川鰈不同組織中的表達(dá)分布。結(jié)果表明：NPY mRNA在腦、心臟、性腺、肝、腸、腎組織都有表達(dá)，但在表達(dá)量上有明顯差異，心臟和腎組織相對(duì)表達(dá)量較少。統(tǒng)計(jì)分析表明：NPY mRNA在腦、性腺組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05）；而在肝和腸組織之間的表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）（圖7）。

圖7 星斑川鰈NPY mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative expression level of NPY mRNA in various tissues of Platichthys stellatus

2.4 饑餓對(duì)星斑川鰈NPY mRNA表達(dá)水平分析

利用Real－time PCR法檢測(cè)了星斑川鰈NPY在不同饑餓程度時(shí)腦組織中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明：NPY在腦組織中的表達(dá)隨著饑餓程度的增加而增加，饑餓72h的NPY mRNA相對(duì)表達(dá)量高于饑餓24h的相對(duì)表達(dá)量，但差異不顯著（P＞0.05）（圖8）。

圖8 饑餓對(duì)NPY mRNA在腦組織中表達(dá)的影響Fig.8 Relative expression level of NPY mRNA in brain tissues of Platichthys stellatus

3 討論

本文通過(guò)SMART－RACE技術(shù)在星斑川鰈腦組織中擴(kuò)增出NPY cDNA序列，其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α－螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲含量相對(duì)比較高。α－螺旋構(gòu)象是相當(dāng)穩(wěn)定的、最普遍的螺旋形式，無(wú)規(guī)則卷曲往往與生物活性相關(guān)，對(duì)外界的理化因子極為敏感。這表明NPY結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有較高的生物活性。

同源性分析比較結(jié)果顯示，不同物種間NPY存在高度一致性，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也同樣地表明了，星斑川鰈NPY與鰈形目魚(yú)類的親緣關(guān)系較近，與美洲擬鰈聚為一支，這說(shuō)明了在物種的進(jìn)化過(guò)程中，NPY基因中對(duì)于發(fā)揮自身功能必須的特定結(jié)構(gòu)，即使經(jīng)過(guò)自然選擇，這些結(jié)構(gòu)依舊被保留了下來(lái)，而存在些許的差異，可以認(rèn)為是適應(yīng)性選擇的必然結(jié)果。

采用Realtime PCR方法檢測(cè)了NPY在各組織中的分布情況。結(jié)果表明NPY mRNA在腦、心臟、性腺、肝、腸、腎組織均有表達(dá)，而且主要在腦組織中表達(dá)，該特征與其他硬骨魚(yú)類相同［10－11］。NPY分布在不同的組織可能對(duì)應(yīng)著不同的生理功能，下丘腦是動(dòng)物攝食的調(diào)控中心，表達(dá)的NPY可以促進(jìn)動(dòng)物攝食；NPY分布在星斑川鰈腸道里，可能參與腸道蠕動(dòng)和消化吸收的調(diào)節(jié)；分布在心臟，可能與調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)提取不同饑餓處理組的星斑川鰈腦組織RNA，應(yīng)用Realtime－PCR對(duì)NPY mRNA表達(dá)量變化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：饑餓導(dǎo)致腦組織中的 NPY mRNA表達(dá)量升高，這與Lopez－Patino［12］和Silverstein［13－14］的研究結(jié)果一致。在對(duì)其他魚(yú)類的研究中也得出：食物缺乏會(huì)使下丘腦中NPY mRNA的表達(dá)量升高，例如斑點(diǎn)叉尾（Ictaluruspunctatus）、冬鰩（Rajaocellata）、巴南牙鲆（Paralichthysorbignyanus）等［15－17］；將NPY重組蛋白通過(guò)腹腔注射到羅非魚(yú)（Oreochromissp.）中，可以促進(jìn)其攝入食物量及其魚(yú)體質(zhì)量的增加［18］。金魚(yú)饑餓24～72h使下丘腦的NPY mRNA含量呈現(xiàn)時(shí)間依存的增加；降低金魚(yú)的食量至正常水平50%，亦使下丘腦的NPY mRNA明顯增加［19］。

NPY的促進(jìn)食欲作用與NPY受體有關(guān)。研究表明，NPY的Y1和Y5受體參與NPY對(duì)食欲的促進(jìn)作用［20－22］。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明：NPY生物合成的最初部位主要在下丘腦弓狀核（ARC），少部分分布于室旁核（PVN）、背中核（DMN）等區(qū)域，弓狀核NPY神經(jīng)元的軸突投射到室旁核，經(jīng)室旁核分泌NPY與特定的受體Y1或Y5結(jié)合，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)攝食過(guò)程。研究顯示，在饑餓、劇烈運(yùn)動(dòng)、體重降低、泌乳等能量嚴(yán)重消耗情況下，下丘腦中的ARC－PVN路徑可被激活，進(jìn)而增加食欲和攝食量［23－25］。

動(dòng)物攝食一直是人們研究的重點(diǎn)內(nèi)容，NPY作為魚(yú)類攝食調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性因子，研究其調(diào)節(jié)機(jī)理具有重要意義，本研究克隆了星斑川鰈的NPY cDNA序列，預(yù)測(cè)了其蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，為在mRNA水平研究NPY生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)，為進(jìn)一步在蛋白水平上研究星斑川鰈的繁殖發(fā)育和遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

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