任小云，張禮生，齊曉陽，安 濤，韓艷華，陳紅印

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

七星瓢蟲Coccinella septempunctata 是優(yōu)良的天敵昆蟲，捕食蚜、蚧等農(nóng)林害蟲，作為商品被擴(kuò)繁與應(yīng)用(John et al.，1998;張禮生等，2014)。該蟲具有顯著的滯育現(xiàn)象，低溫短日照可誘發(fā)其進(jìn)入滯育，對(duì)滯育七星瓢蟲營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存、抵御逆境脅迫能力的研究，有助于深入探索滯育機(jī)理，指導(dǎo)滯育貯存，延長天敵產(chǎn)品貨架期(張禮生等，2009，2014)。滯育是部分昆蟲適應(yīng)不良環(huán)境而形成的暫時(shí)停止發(fā)育的遺傳特性 (Hahn and Denlinger，2007;Denlinger et al.，2014)，對(duì)昆蟲種群維持具有重要意義。滯育期間，昆蟲不取食或很少取食，通過特殊的代謝調(diào)節(jié)，使體內(nèi)重要生物活性物質(zhì)的儲(chǔ)存與利用發(fā)生改變(Hahn and Denlinger，2007)，減慢體內(nèi)代謝速率(Watanabe and Tanaka，1998;Denlinger，2002)，減少能量消耗，使昆蟲在逆境脅迫中得以存活 (Goto et al.，2001;Denlinger，2002)。如以末齡幼蟲滯育的棉紅鈴蟲Pectinophora gossypiella，其脂肪含量比非滯育個(gè)體高50%;滯育庫蚊Culex.pipiens的脂肪和碳水化合物比非滯育個(gè)體高出近2 倍(Hahn and Denlinger，2007)，這為昆蟲在不利環(huán)境中的能量需求提供了保障。此外，滯育期間昆蟲通過積累多元醇、糖類、蛋白質(zhì)等抗凍保護(hù)物質(zhì)，增強(qiáng)昆蟲的過冷卻能力，提高抗逆性(丁惠梅 等，2011;Li et al.，2014)。過冷卻 點(diǎn)(supercooling point，SCP)是溫度在逐漸降低的過程中昆蟲體液開始結(jié)冰時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度(Li et al.，2014)，與其他生理指標(biāo)(如體重、含水量、抗凍蛋白、脂肪等)的關(guān)系可以說明昆蟲的耐寒性(郅倫山，2005;張珺等，2005;郅倫山等，2007;薛冬等，2014;Xu et al.，2015)。

滯育期間，昆蟲生化物質(zhì)的變化是決定昆蟲能否成功度過不利環(huán)境的因素之一，過冷卻點(diǎn)是衡量昆蟲耐寒性的重要指標(biāo)。滯育昆蟲有海藻糖積累型和糖原積累型兩種能量積累形式，七星瓢蟲屬哪種尚不明確。針對(duì)七星瓢蟲正常發(fā)育、滯育及滯育解除個(gè)體的過冷卻點(diǎn)和生化物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)七星瓢蟲的滯育類型做出判斷，根據(jù)過冷卻點(diǎn)測(cè)定結(jié)果及能量儲(chǔ)存方式可對(duì)七星瓢蟲的擴(kuò)散、保護(hù)、利用及人工飼料的研發(fā)提供新思路，并可對(duì)七星瓢蟲的滯育機(jī)制的揭示進(jìn)行補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及處理方法

七星瓢蟲采自中國農(nóng)科學(xué)院麥田，其飼養(yǎng)方法參照王偉(2013)。七星瓢蟲卵、幼蟲、蛹的飼養(yǎng)條件一致，置于人工氣候箱中飼養(yǎng)，參數(shù)設(shè)置為溫度24℃±1℃、相對(duì)濕度70% ±10%、光周期L16 ∶D8。

正常發(fā)育組成蟲飼養(yǎng)條件與卵、幼蟲、蛹飼養(yǎng)條件一致，待成蟲產(chǎn)卵后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

滯育組成蟲的飼養(yǎng)方法是，將羽化后的成蟲配對(duì)，放入人工氣候箱中飼養(yǎng)，其參數(shù)設(shè)置分別為溫度18℃±1℃、相對(duì)濕度70% ±10%、光周期L10 ∶D14。滯育判斷方法參考王偉(2013)。滯育雌蟲用于后續(xù)試驗(yàn)。

滯育解除組的飼養(yǎng)方法是，將滯育40 d 未產(chǎn)卵個(gè)體置于對(duì)照組成蟲飼養(yǎng)的條件下，以產(chǎn)卵作為滯育解除的判斷標(biāo)準(zhǔn)。將產(chǎn)卵后的雌成蟲用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

大豆蚜飼養(yǎng)方法參考忻亦芬(1982)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含水量和脂肪含量的測(cè)定

分別取各處理下的雌成蟲10 頭，用蒸餾水清洗后，再用濾紙擦干，于精確度為0.1 mg的電子天平上稱各處理下成蟲的重量，記為濕重(wet weight，WW);然后，置于60℃干燥箱中48 h 烘至恒重，稱其重量，記為干重(dry weight，DW)。成蟲含水量為:(WW-DW)/WW×100。重復(fù)3 次。

分別取各處理下雌成蟲10 頭，單頭稱重，處理方法同含水量測(cè)定方法相同，記錄單頭雌蟲的濕重(WW)及干重(DW)。脂肪提取方法參考楊光平(楊光平，2013)。重復(fù)3 次。

1.2.2 總糖、海藻糖、糖原含量的測(cè)定

參照仵均祥(2004)、孔璐(2013)的方法，稍有改進(jìn)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考孔璐(2013)，重復(fù)3 次。

總糖的提取:取3個(gè)不同處理下的雌成蟲各10 頭，用蒸餾水洗凈后擦干，單頭至于EP 管中稱重。加入100μL 10% 三氯乙酸溶液，用圓頭玻璃棒研磨，充分勻漿，然后用400μL 10% 三氯乙酸溶液分兩次沖洗玻璃棒，振蕩，充分抽提;充分混勻后5000 rpm 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管中，向殘?jiān)性俅渭尤?00μL 10%三氯乙酸溶液抽提一次，離心，合并上清液并混合均勻。取200μL 總糖提取液，加入800μL 蒸餾水混勻后，用于總糖測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3 次

海藻糖、糖原的提取:取各處理下雌成蟲各10 頭，用蒸餾水清洗后擦干，單頭置于EP 管中稱重。加入50μL 10% 三氯乙酸溶液，用圓頭玻璃棒研磨，充分勻漿，用100μL 10% 三氯乙酸分兩次沖洗玻璃棒。充分混勻后，5000 rpm 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中。沉淀再用50μL 10% 三氯乙酸抽提1 次，離心，合并上清液。加入無水乙醇800μL，置于4℃冰箱中16 h，保留上清、棄沉淀。10000 rpm 離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一2 mL 離心管中;取200μL 上清液于另一10 mL 離心管中，加入400μL 0.15 mol/L H2SO4，混勻后沸水浴10 min;冷卻至室溫，加入400μL 30% KOH，混合均勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫待測(cè)海藻糖用。向沉淀中，加入1 mL MilliQ 水，90℃水浴溶解;將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中待測(cè)糖原用。后續(xù)處理同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程相同。每個(gè)處理重復(fù)3 次

1.2.3 山梨醇、甘油含量的測(cè)定

山梨醇、甘油含量的提取和測(cè)定參考李玉艷(2011)的方法。每個(gè)處理以10 頭雌蟲為一次重復(fù)，重復(fù)3 次。

1.2.4 總蛋白含量的測(cè)定

總蛋白提取方法參考成衛(wèi)寧等(2008)，采用Bradford 法測(cè)定。每次實(shí)驗(yàn)取單頭雌成蟲為一次重復(fù)，各處理重復(fù)30 次。

1.2.5 過冷卻點(diǎn)的測(cè)定

七星瓢蟲過冷卻點(diǎn)的測(cè)定使用SUN-II 型智能昆蟲過冷卻點(diǎn)測(cè)定儀。每次試驗(yàn)以單頭雌成蟲為一次重復(fù)，正常發(fā)育組為25 次重復(fù)，滯育組為24 次重復(fù)，滯育解除組為20 次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 9.3 ANOVA 程序?qū)ζ咝瞧跋x在不同條件下的SCP、含水量、總糖、海藻糖、糖原、甘油、山梨醇及總蛋白含量進(jìn)行方差分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用Duncan's 新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 滯育不同階段七星瓢蟲含水量的比較

滯育對(duì)七星瓢蟲的含水量有顯著影響(圖1)。在滯育條件下，七星瓢蟲含水量為58.11% ±6.55%，顯著低于對(duì)照組68.49% ±2.26%和滯育解除組65.84% ±4.02% (F=8.15，P＜0.01)滯育解除后，七星瓢蟲含水量增加，為七星瓢蟲滯育解除后生長、繁殖提供適宜的內(nèi)環(huán)境。

圖1 正常發(fā)育、滯育及滯育解除七星瓢蟲含水量Fig.1 Water content of normal development，diapause and post-diapause Coccinella septempunctata

2.2 滯育不同階段七星瓢蟲脂肪含量比較

七星瓢蟲在3 種不同處理下的脂肪含量差異如圖2 所示，對(duì)照組80.04 ±15.82μg/mg、滯育組173.66 ± 19.01μg/mg、滯育解除組83.83 ±12.54μg/mg。滯育對(duì)脂肪的積累有顯著影響(F=8.48，P＜0.01)，滯育解除組與對(duì)照組脂肪含量差異不顯著，說明七星瓢蟲在滯育期間儲(chǔ)存了大量脂肪，滯育解除后脂肪被分解轉(zhuǎn)化為其它營養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 滯育不同階段七星瓢蟲總糖、海藻糖、糖原含量比較

圖2 正常發(fā)育、滯育及滯育解除個(gè)體脂肪含量Fig.2 Lipid in normal development，diapause and post-diapause Coccinella septempunctata

七星瓢蟲滯育期間總糖、糖原含量分別為10.60 ±0.54μg/mg、8.72 ±0.24μg/mg，正常發(fā)育組總糖、糖原含量分別為3.12 ±0.21μg/mg、1.28 ±0.62μg/mg，滯育解除組總糖、糖原含量為3.09 ±0.12μg/mg、1.47 ±0.22μg/mg。滯育組總糖和糖原含量顯著高于正常發(fā)育組及滯育解除組，有極顯著性差異(F=46.57，P=0.0006;F=114.25，P＜0.0001);總糖和糖原在滯育組、滯育解除組之間無顯著性差異。海藻糖含量在三組中的差異不顯著(F=0.79，P=0.4946)，正常發(fā)育組、滯育組及滯育解除組的海藻糖含量分別為1.57 ±0.10μg/mg、1.31 ±0.27μg/mg、1.56±0.41μg/mg (圖3)。

圖3 正常發(fā)育、滯育及滯育解除七星瓢蟲的總糖、海藻糖、糖原Fig.3 Total sugars，trehalose and glycogen in normal development，diapause and post-diapause Coccinella septempunctata

2.4 滯育不同階段七星瓢蟲甘油、山梨醇含量比較

滯育期間甘油(1.74 ±0.50μg/mg)含量低于正常發(fā)育組(2.10 ±0.84μg/mg)及滯育解除組(2.38 ±0.46μg/mg)，滯育組山梨醇(9.84 ±3.02μg/mg)低于正常發(fā)育組(16.57±4.10μg/mg)和滯育解除組(12.54 ±2.77μg/mg)。三組中甘油、山梨醇差異均不顯著(F=1.33，P=0.3004;F=1.69，P=0.2387)。推測(cè)甘油、山梨醇在七星瓢蟲滯育期間轉(zhuǎn)化為脂肪和(或)糖原;滯育解除后，脂肪、糖原轉(zhuǎn)化為其它生命物質(zhì)，甘油、山梨醇含量逐漸上升(圖4)。

圖4 正常發(fā)育、滯育及滯育解除七星瓢蟲的甘油、山梨醇Fig.4 Glycerol and sorbitol in normal development，diapause and post-diapause Coccinella septempunctata

2.5 滯育不同階段七星瓢蟲總蛋白含量比較

七星瓢蟲在正常發(fā)育、滯育、滯育解除條件下的總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果如圖5 所示。滯育條件下的總蛋白含量(49.20 ±3.80μg/mg)顯著低于正常發(fā)育組(71.02 ±6.15μg/mg)和滯育解除組 (69.45 ± 4.66μg/mg)(F=46.57，P=0.0006)，正常發(fā)育組和滯育解除組之間無顯著差異，說明滯育期間七星瓢蟲的活動(dòng)能力減弱，主要表現(xiàn)在卵巢發(fā)育被完全抑制;而滯育解除后的個(gè)體卵巢發(fā)育，體內(nèi)總蛋白的表達(dá)量增加，恢復(fù)至正常發(fā)育狀態(tài)。

2.6 滯育不同階段七星瓢蟲過冷卻點(diǎn)比較

過冷卻點(diǎn)的變化情況與含水量變化情況一致(圖6)，滯育組SCP 較正常組低近2℃，而滯育解除組SCP 較滯育組高近1℃，由此可以看出滯育期間的低溫馴化能提高七星瓢蟲的耐寒性。

圖5 正常發(fā)育、滯育及滯育解除七星瓢蟲的總蛋白Fig.5 Proteins in normal development，diapause and post-diapause Coccinella septempunctata

圖6 正常發(fā)育、滯育及滯育解除七星瓢蟲過冷卻點(diǎn)Fig.6 SCP changes in normal development，diapause and post-diapause Coccinella septempunctata

3 結(jié)論與討論

滯育通常被描述為低代謝的、抗逆能力增強(qiáng)的緩慢發(fā)育狀態(tài) (Ragland et al.，2010;Zhang et al.，2011)，主要體現(xiàn)在昆蟲的活動(dòng)能力減弱、體內(nèi)發(fā)生了一系列的生理生化變化 (Tauber and Tauber，1976;Hodek，2002)，如熱休克蛋白表達(dá)量和表達(dá)模式發(fā)生變化(Rinehart et al.，2007)，脂肪、糖原、儲(chǔ)存蛋白表達(dá)增加(Watanabe and Tanaka，1998;Papanastasiou et al.，2011)等。在滯育期間昆蟲必須儲(chǔ)存充足的營養(yǎng)物質(zhì)，供其滯育期間存活所需的能量來源及滯育解除后的發(fā)育，這些營養(yǎng)物質(zhì)主要包括脂肪、碳水化合物、氨基酸及其他必需的小分子營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、礦物質(zhì)等(Hahn and Denlinger，2011)。滯育的昆蟲進(jìn)入了一種可選擇的發(fā)育途徑，減慢了它們的發(fā)育速率，這些營養(yǎng)物質(zhì)的代謝方式為該發(fā)育途徑所需(Ko?tál，2006;Hahn and Denlinger，2011)，如滯育期間含水量降低，糖原、脂肪等冷凍保護(hù)物質(zhì)含量增加，提高了昆蟲的耐寒性。

滯育期間，昆蟲的含水量低于非滯育個(gè)體(Danks，2000)。體內(nèi)含水量的降低，一方面會(huì)增加體內(nèi)溶質(zhì)濃度，減少因低溫產(chǎn)生晶核造成的危害，提高其耐寒能力 (張擁軍，2007;唐斌等，2014)，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性;另一方面，水是生命活動(dòng)的載體，含水量的降低減慢了昆蟲的活動(dòng)及昆蟲體內(nèi)的新陳代謝水平，有利于昆蟲在滯育期間的存活。本研究中，七星瓢蟲在滯育條件下含水量顯著下降，降低了七星瓢蟲的水化作用及新陳代謝速率;過冷卻點(diǎn)降低表明七星瓢蟲的耐寒性增強(qiáng)，含水量的降低對(duì)瓢蟲耐寒性的增強(qiáng)有一定作用，與郅倫山等(2007)的研究一致;滯育的解除需要一定的濕度，如果水分缺少滯育持續(xù)的時(shí)間會(huì)延長(Lees，1956)，因此七星瓢蟲需要大量水分輔助其打破滯育，恢復(fù)正常的生長、繁殖，含水量顯著提高(65.84% ±4.02%)。滯育解除個(gè)體的過冷卻點(diǎn)較正常發(fā)育組降低，表明滯育的冷馴化可以提高七星瓢蟲的耐寒性。

七星瓢蟲滯育期間的總糖、糖原、脂肪含量顯著升高，海藻糖、甘油、山梨醇含量降低不顯著。糖原和脂肪是昆蟲主要營養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存形式(Hahn and Denlinger，2007;Arrese and Soulages，2010;Vuka?inovic'et al.，2013)，Zygaena trifolii 滯育期間儲(chǔ)存了大量的糖原和脂肪，在滯育期間逐漸被利用(Wolfgang et al.，1995);歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis 滯育個(gè)體的脂肪中含有大量的不飽和脂肪酸，一方面為歐洲玉米螟提供了能量來源，另一方面作為抗凍保護(hù)劑提高歐洲玉米螟的耐寒性(Vuka?inovic'et al.，2013)。海藻糖是昆蟲血糖的主要成分，是昆蟲體內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的轉(zhuǎn)運(yùn)形式(王蔭長，1994)。一些昆蟲如大斑芫菁Mylabris phalerata (朱芬等，2008)、麥紅吸漿蟲Sitodiplosis mosellana (仵均祥等，2004)、梨小食心蟲Grapholitha molesta (郭婷婷等，2013)、煙蚜繭蜂Aphidius gifuensis (李玉艷，2011)等在滯育期間海藻糖含量高于非滯育個(gè)體，提高了昆蟲體液的血糖濃度，其功能是作為抗凍保護(hù)劑增強(qiáng)昆蟲的抗逆能力，而不是營養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存方式(Hahn and Denlinger，2007)。七星瓢蟲在滯育期間甘油、山梨醇、海藻糖含量下降不明顯，有可能是作為前體物質(zhì)為脂肪和(或)糖原的合成提供原料;而脂肪、糖原則作為營養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存庫，為七星瓢蟲滯育期間及滯育解除后的發(fā)育提供能量。滯育七星瓢蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，滯育期間七星瓢蟲代謝速率顯著降低，促進(jìn)了脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)與貯存(劉遙，2014);Phospoglyceromutase 在七星瓢蟲滯育期間上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該蟲在滯育期間糖異生速率加快，進(jìn)而促進(jìn)了糖原的合成(任小云等，2014)，與本研究的脂肪、糖原研究結(jié)果相符。Hayakawa 和Chino (1982)提出滯育昆蟲的糖醇積累方式至少可分為兩種:糖原積累型和海藻糖積累型。根據(jù)分析結(jié)果，我們推斷七星瓢蟲滯育屬于糖原積累型。七星瓢蟲在滯育期間總糖含量顯著升高，有可能是小分子糖類含量較高，在滯育期間瓢蟲的抗寒性增強(qiáng)起著重要作用;有研究表明在滯育、低溫等不利環(huán)境下生物體內(nèi)不飽和脂肪酸的含量升高 (Maryam et al.，2007;Vuka?inovic'et al.，2013;易杰群等，2015)，作為抗凍保護(hù)劑保證生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，本研究發(fā)現(xiàn)七星瓢蟲滯育脂肪含量是正常發(fā)育及滯育解除個(gè)體的2 倍，推測(cè)有可能是不飽和脂肪酸含量升高，且不飽和脂肪酸作為主要的抗凍保護(hù)劑，該結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。在已研究的滯育昆蟲中，其蛋白質(zhì)含量主要呈下降趨勢(shì)，如煙蚜繭蜂在滯育期間總蛋白含量隨著滯育深度的增加逐漸下降(李玉艷，2011)，中華通草蛉Chrysoperla sinica 滯育個(gè)體總蛋白含量顯著高于非滯育個(gè)體(許永玉，2001);但在某些種類中，如馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata 滯育個(gè)體蛋白質(zhì)含量較非滯育個(gè)體高(de Kort，1990)。在本研究中，七星瓢蟲滯育期間總蛋白較正常發(fā)育及滯育解除后個(gè)體的總蛋白含量低，說明七星瓢蟲在滯育期間生命活動(dòng)減弱。前期研究表明，七星瓢蟲以成蟲滯育，其卵巢發(fā)育程度低、卵巢中無卵黃沉積，屬于卵巢發(fā)育被完全抑制型(王偉等，2011)，進(jìn)一步說明七星瓢蟲在滯育期間生命活動(dòng)減弱，營養(yǎng)物質(zhì)的代謝速率減慢。

對(duì)七星瓢蟲滯育耐寒性及營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存的研究，有利于我們了解七星瓢蟲的擴(kuò)散分布情況和滯育機(jī)制，為我們保護(hù)和充分利用該天敵昆蟲提供了理論依據(jù)。

對(duì)七星瓢蟲正常發(fā)育、滯育及滯育解除后個(gè)體的生化物質(zhì)變化及過冷卻點(diǎn)的研究表明，滯育誘發(fā)七星瓢蟲發(fā)生顯著的代謝適應(yīng)，蛋白質(zhì)含量顯著降低，抑制新陳代謝進(jìn)程;糖脂含量顯著升高，保障了七星瓢蟲滯育維持及解除后發(fā)育的能量需求;七星瓢蟲滯育屬糖原積累型;滯育個(gè)體過冷卻點(diǎn)大幅下降，耐寒性顯著提升;且經(jīng)過滯育的低溫馴化后，滯育解除個(gè)體耐寒性增強(qiáng)，這對(duì)七星瓢蟲的人工釋放范圍及遷飛、擴(kuò)散提供了參考。

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