曹棟棟，詹 艷，王 洋，阮曉麗，徐小優(yōu)

(1.浙江農(nóng)科種業(yè)有限公司,浙江杭州 310021;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核利用研究所,浙江杭州 310021; 3.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 311300)

雜交水稻種子純度鑒定方法對(duì)比研究

曹棟棟1，2，詹 艷1，王 洋3，阮曉麗1，徐小優(yōu)1

(1.浙江農(nóng)科種業(yè)有限公司,浙江杭州 310021;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核利用研究所,浙江杭州 310021; 3.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 311300)

種子純度是水稻種子質(zhì)量的核心指標(biāo),準(zhǔn)確鑒定種子純度對(duì)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定、假種辨別、產(chǎn)權(quán)糾紛等具有重要作用。本文概述并分析了雜交水稻種子純度鑒定的幾種常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn),并對(duì)目前應(yīng)用最廣泛的田間種植鑒定和SSR分子標(biāo)記鑒定方法進(jìn)行了比較分析,認(rèn)為SSR分子標(biāo)記技術(shù)適用于大規(guī)模、快速、準(zhǔn)確鑒定雜交水稻種子純度。

雜交水稻;種子純度;田間鑒定;SSR分子標(biāo)記

文獻(xiàn)著錄格式:曹棟棟,詹艷,王洋,等.雜交水稻種子純度鑒定方法對(duì)比研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,56(5):718-722.

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20150553

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基本的生產(chǎn)資料。種子質(zhì)量是種子潛力的綜合表現(xiàn),它決定了種子萌發(fā)的潛力、出苗的一致性和幼苗正常發(fā)育的能力[1]。種子質(zhì)量的高低直接影響農(nóng)作物產(chǎn)量和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)。種子質(zhì)量包括品種質(zhì)量和播種質(zhì)量2方面,品種質(zhì)量可以用“真”和“純”表示,即品種的真實(shí)性和純度;播種質(zhì)量可以用“凈、壯、飽、健、干、強(qiáng)”6個(gè)字概括,包括種子凈度、發(fā)芽力、生活力、活力、健康狀況、水分和重量[2]。種子質(zhì)量是種業(yè)經(jīng)營的核心。種子質(zhì)量比一般商品質(zhì)量影響更長久、更深遠(yuǎn)、更廣泛[3]。種子質(zhì)量檢驗(yàn)是保證種子質(zhì)量的關(guān)鍵。目前我國種子質(zhì)量檢驗(yàn)內(nèi)容包括種子純度、凈度、水分和發(fā)芽率4項(xiàng)指標(biāo)。種子純度是種子質(zhì)量的核心指標(biāo),準(zhǔn)確鑒定種子純度對(duì)種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定、假種辨別、產(chǎn)權(quán)糾紛起著重要作用。它是保證良種優(yōu)良遺傳性狀充分得到發(fā)揮的前提,是促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的有效措施,也是防止良種混雜退化,提高種子質(zhì)量和產(chǎn)品品質(zhì)的必要手段[4]。此外,種子純度也是種子企業(yè)生存的根本,是企業(yè)種子加工、銷售決策的關(guān)鍵依據(jù)[5]。目前,種子純度檢測(cè)方法主要可分為田間小區(qū)種植鑒定和室內(nèi)檢驗(yàn)。其中,室內(nèi)檢驗(yàn)法主要包括種子形態(tài)鑒定、幼苗鑒定、蛋白質(zhì)指紋鑒定和DNA分子標(biāo)記鑒定等。本文將以水稻為例,對(duì)種子純度檢測(cè)的室內(nèi)檢驗(yàn)和田間鑒定方法進(jìn)行比較分析,并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行探討。

1 室內(nèi)檢驗(yàn)方法簡述

1.1 蛋白質(zhì)指紋鑒定

種子中的蛋白質(zhì)組分是基因表達(dá)的產(chǎn)物,記錄了物種在發(fā)育過程中的親緣關(guān)系,以及種間與品種間的遺傳差異[6],通過電泳技術(shù)得到多態(tài)性的蛋白質(zhì)指紋圖譜,可用于鑒別不同品種的真實(shí)性和純度,即蛋白質(zhì)指紋鑒定技術(shù)。蛋白質(zhì)指紋鑒定技術(shù)包括同工酶電泳和蛋白質(zhì)電泳。吳建梅等[7]采用酯酶同工酶電泳法,對(duì)10份特優(yōu)系列組合進(jìn)行了純度鑒定,發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果存在較好的一致性。然而,由于同工酶的表達(dá)在時(shí)間和空間上存在特異性,影響了同工酶在不同組織或器官中的分布和活性,同時(shí)環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)的影響也會(huì)使同工酶發(fā)生改變[8],因此同工酶電泳技術(shù)在雜交水稻組合種子純度的鑒定上仍存在一定的局限性[9]。

蛋白質(zhì)電泳法是根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異來揭示基因的差異,由于直接測(cè)定的是蛋白質(zhì),因此具有快速、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。目前用于檢測(cè)的種子蛋白質(zhì)主要是種子的貯藏蛋白質(zhì),如醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白等[10]。張鳳等[11]采用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢測(cè)了4個(gè)三系雜交稻組合和7個(gè)雜交稻F1代種子的純度,結(jié)果表明鹽溶蛋白多態(tài)性豐富,差異明顯,蛋白質(zhì)特征帶穩(wěn)定,且鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定結(jié)果基本吻合。此外,利用SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳方法鑒定作物真實(shí)性和純度,已在辣椒[12]、水稻[13]、啤酒大麥[14]和菜豆[15]中獲得成功。但由于蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,不能完全顯示品種間的多態(tài)性,且受種子發(fā)育階段及表達(dá)器官的影響,有時(shí)不夠穩(wěn)定,因而這種方法在種子純度鑒定上的應(yīng)用仍較少。

1.2 DNA分子標(biāo)記鑒定

DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性,通過比較不同品種基因組DNA的結(jié)構(gòu)與組成,從鑒定品種DNA水平上的差異來鑒別品種的真實(shí)性和純度[16]。該技術(shù)的本質(zhì)是反映生物個(gè)體或種群間基因組種子某種差異的特異性DNA片段[17],因而具有不受外界環(huán)境因素影響、不受空間和時(shí)間限制、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)[18]。常用的分子標(biāo)記可分為4類[19]:一是限制性酶結(jié)合使用分子雜交技術(shù)的標(biāo)記,如RFLP標(biāo)記;二是經(jīng)PCR擴(kuò)增的標(biāo)記,如RAPD標(biāo)記和SSR標(biāo)記;三是限制性酶結(jié)合使用PCR擴(kuò)增的標(biāo)記,如AFLP標(biāo)記,四是基于單核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記,如SNP。與RFLP和AFLP技術(shù)相比,SSR技術(shù)是基于PCR基礎(chǔ)上的標(biāo)記,操作相對(duì)簡單,且其穩(wěn)定性和重復(fù)性優(yōu)于RAPD標(biāo)記。SNP標(biāo)記由于檢測(cè)儀器和費(fèi)用昂貴,技術(shù)相對(duì)不成熟。因此目前在雜交水稻種子純度和真實(shí)性鑒定中最具有應(yīng)用潛力的是SSR標(biāo)記。

SSR(Simple Sequence Repeats,簡單重復(fù)序列)是指基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA,廣泛分布于基因組的不同位置,長度一般在200 bp以下,相同座位上的重復(fù)序列由于重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生了等位基因的多態(tài)性。根據(jù)同一類SSR兩端序列的相對(duì)保守性,設(shè)計(jì)特異引物,通過PCR擴(kuò)增、電泳便可揭示不同個(gè)體在某個(gè)SSR位點(diǎn)上的多態(tài)性[20]。

彭鎖堂等[21]利用SSR技術(shù)分析了9個(gè)雜交稻組合及其親本,能有效區(qū)分所有恢復(fù)系和大部分不育系;對(duì)雜交稻組合汕優(yōu)63和兩優(yōu)培九進(jìn)行單粒種子SSR鑒定,所測(cè)純度與田間種植鑒定純度非常接近;這些結(jié)果表明SSR標(biāo)記適合于雜交水稻種子純度鑒定。劉之熙等[22]利用多態(tài)性好的2對(duì)SSR標(biāo)記引物分別對(duì)參試的威優(yōu)46和金優(yōu)207進(jìn)行純度鑒定,能有效區(qū)分摻假的種子與真種子;且在該研究中使用的優(yōu)化的SSR分子標(biāo)記體系,縮短了檢測(cè)時(shí)間,有助推進(jìn)該技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用。2007年,全國農(nóng)技推廣中心頒布GB/T 20396—2006三系雜交水稻及親本真實(shí)性和品種純度鑒定DNA分析方法,及NY/T 1433—2007水稻品種鑒定DNA指紋方法。2013年,利用已研制的水稻DNA指紋圖譜鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),我國完成了900份已知水稻品種的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)采集,為水稻新品種測(cè)試和已知品種數(shù)據(jù)庫建設(shè)提供了技術(shù)與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐,同時(shí)也為雜交水稻品種鑒定提供了依據(jù)。

除了上述DNA分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)外,SSR標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)還體現(xiàn)在其標(biāo)記數(shù)量多,提供的信息量大,鑒定結(jié)果準(zhǔn)確等方面。尤其是水稻基因組測(cè)序的完成,使得引物序列愈加豐富,也推進(jìn)了該方法在品種純度和真實(shí)性鑒定中的應(yīng)用。其次,SSR標(biāo)記具有共顯性,一個(gè)標(biāo)記往往具有多個(gè)等位基因,可在不同品系間獲得多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn),特別適用于雜交種的純度鑒定[23]。再次,SSR分子標(biāo)記鑒定程序簡單,所需時(shí)間短;且鑒定費(fèi)用低,一般分子檢測(cè)室均有能力開展。特別是國產(chǎn)分子檢測(cè)儀器設(shè)備和藥品耗材的開發(fā),很大程度上降低了樣品檢測(cè)的費(fèi)用。因此,該項(xiàng)技術(shù)特別適合于種子室內(nèi)檢驗(yàn)設(shè)施不太完善的中小型種子企業(yè)或科研院所。

在雜交水稻種子純度鑒定過程中,一般將田間種植的混雜類型分為親本(不育系和恢復(fù)系)、串粉混雜和其他類型(變異株和混雜的常規(guī)品種等)[24]。SSR標(biāo)記可準(zhǔn)確區(qū)分不育系和恢復(fù)系,對(duì)于混入的常規(guī)品種也易區(qū)分,但對(duì)于串粉混雜和變異株則較難區(qū)分。如郭承亮等[25]利用SSR標(biāo)記RM21對(duì)兩優(yōu)287正季田間小區(qū)鑒定調(diào)查出的10種雜株類型的特異性進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記只能區(qū)分其中6種雜株類型。針對(duì)這些問題,李進(jìn)波等[26]認(rèn)為可針對(duì)某一雜交稻組合,在田間收集此雜交稻的串粉混雜植株類型,從獲得的多態(tài)性標(biāo)記中進(jìn)一步篩選出特異標(biāo)記,以提高分子鑒定的準(zhǔn)確性。郭承亮[5]利用篩選的多對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)雜交水稻種子純度鑒定中的雜株類型進(jìn)行定量鑒定,可確定種子所含的雜株類型及其各自所占比例,為種子企業(yè)提供了更準(zhǔn)確、更全面的質(zhì)量信息和可操作性強(qiáng)的加工處理方法。

1.3 其他室內(nèi)鑒定方法

除了上述室內(nèi)鑒定方法外,還有種子形態(tài)鑒定法、幼苗鑒定法和近紅外光譜法等。利用種子的特異性形態(tài)特征區(qū)分不同的品種是品種鑒定中最基本、最簡單的方法。在雜交水稻種子形態(tài)鑒定中,主要是依據(jù)種子形狀、大小、顏色、茸毛長短稀疏、米粒色澤等,逐粒觀察。但該方法對(duì)于鑒定親緣關(guān)系近的品種有難度。幼苗鑒定法是讓種子在溫室中培養(yǎng)到一定階段后,對(duì)幼苗進(jìn)行鑒定;或讓植株在特殊逆境條件下生長,通過檢測(cè)抗性的不同進(jìn)行區(qū)分[11]。但與種子形態(tài)鑒定類似,該方法也很難區(qū)分遺傳背景相近的品種。近紅外光譜檢測(cè)是一項(xiàng)無損、快速的檢測(cè)技術(shù),Attaviroj等[27]利用該技術(shù)檢測(cè)了5種潮濕稻谷的純度,其準(zhǔn)確度高達(dá)97%～100%,該技術(shù)可作為一種常規(guī)種子純度檢測(cè)技術(shù)。但由于近紅外光譜需要針對(duì)不同品種建立相關(guān)的模型進(jìn)行分析,操作難度較大,不適用于大規(guī)模種子純度鑒定。

2 田間鑒定

田間鑒定是傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法,即從種子批中選取一些具有代表性的樣品播種到田間,其鑒定時(shí)期包括從種子發(fā)芽成苗到種子收獲的整個(gè)過程。一般在苗期、分蘗盛期、抽穗揚(yáng)花期和成熟期分4次進(jìn)行鑒定,每次鑒定時(shí)記載鑒定樣品與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品的差異,對(duì)變異株、異型株等雜株掛牌做好標(biāo)記,在成熟期進(jìn)行最后一次鑒定時(shí)匯總[28]。鑒定主要從4個(gè)方面入手:(1)植株性狀的比較,如株高、莖稈粗壯程度、分蘗力、莖色、節(jié)間長度、莖節(jié)色、苗期的芽鞘色等;(2)葉片性狀的比較,如葉片寬窄、葉片長短、葉色深淺、茸毛多少、葉片形態(tài)、劍葉角度、卡頸程度等;(3)穗部性狀的比較,如穗形、穗子長短、著粒密度、芒的長度或有無等;(4)谷粒形狀比較,如谷粒長度、千粒重大小、顏色、稃尖顏色、米粒色澤、米粒形狀等。

田間小區(qū)種植鑒定是目前公認(rèn)的雜交水稻種子純度鑒定中比較可靠、準(zhǔn)確的鑒定方法,也是國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的、目前鑒定雜交水稻種子純度應(yīng)用最廣泛的方法[29]。目前,田間鑒定方法主要包括海南種植鑒定和正季種植鑒定。海南種植鑒定具有鑒定相對(duì)準(zhǔn)確,時(shí)間相對(duì)提前的優(yōu)點(diǎn),但海南冬季屬于短日低溫條件,感光類型及兩系不育系均表現(xiàn)為正常結(jié)實(shí),對(duì)雜交稻尤其是兩系雜交稻種子純度的鑒定結(jié)果往往失真;正季種植鑒定具有鑒定準(zhǔn)確、鑒定結(jié)果與大田生產(chǎn)實(shí)際吻合度高的優(yōu)點(diǎn),但時(shí)間明顯滯后[5]。此外,田間種植鑒定所需周期長,費(fèi)工占地,且需要鑒定人員具有專業(yè)知識(shí)和豐富的工作經(jīng)驗(yàn),因而不太適應(yīng)當(dāng)前水稻種子生產(chǎn)的需要。

3 田間鑒定與SSR分子標(biāo)記檢驗(yàn)結(jié)果比較

目前,種子企業(yè)常用的水稻種子純度鑒定方法主要是田間種植鑒定和SSR分子標(biāo)記鑒定。以5個(gè)水稻品種為材料,分別在上海、江西、海南、廣西、江蘇開展田間小區(qū)種植鑒定和SSR分子標(biāo)記檢測(cè),將2種檢測(cè)方法的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果(表1)表明,SSR分子標(biāo)記純度鑒定結(jié)果與田間檢驗(yàn)結(jié)果存在一定差異,但偏差不大。各品種間2種方法鑒定結(jié)果的偏差存在一定差異,主要原因是Y兩優(yōu)689、株兩優(yōu)06等品種是兩系雜交水稻,田間明顯可辨的雜株多為不育系,與真品種性狀很容易辨別;內(nèi)5優(yōu)8015、II優(yōu)7954、錢優(yōu)1號(hào)等品種是三系雜交水稻,雜株多由其他品種串粉形成,其籽粒形狀,植株生育期都與真品種較接近,難以分辨,而利用SSR分子標(biāo)記鑒定能將田間不能判斷出的真異(雜)種子進(jìn)行辨別,所以其得到的雜株率略高于田間小區(qū)鑒定結(jié)果,得出的雜交稻品種純度結(jié)果更加可靠、準(zhǔn)確。此外,周會(huì)[30]對(duì)23個(gè)雜交水稻品種的226份樣品進(jìn)行了SSR分子標(biāo)記鑒定、田間正季種植鑒定和海南異地種植鑒定分析,結(jié)果表明SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間正季鑒定基本一致,最大相差11.2百分點(diǎn),平均差距為0.9百分點(diǎn);而海南異地種植鑒定結(jié)果與正季鑒定結(jié)果差異較大,最大相差44.0百分點(diǎn),平均差距為3.6百分點(diǎn),據(jù)此認(rèn)為SSR分子標(biāo)記鑒定兩系雜交水稻品種純度結(jié)果比海南異地種植鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。郭奕生等[31]利用SSR標(biāo)記和田間小區(qū)種植鑒定同時(shí)對(duì)雜交稻品種進(jìn)行了純度鑒定,鑒定結(jié)果分別為93.0%和93.5%,結(jié)果很接近,說明利用SSR標(biāo)記進(jìn)行雜交稻種子純度鑒定是可行的。

4 展望

種子純度是水稻種子質(zhì)量的核心標(biāo)準(zhǔn)之一,但種子純度檢測(cè)手段的不便性卻長期困擾著中國水稻種子行業(yè)。將一套準(zhǔn)確、快速、簡單、經(jīng)濟(jì)的雜交水稻種子純度檢測(cè)技術(shù)推廣到各種子企業(yè),可滿足種子企業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營的迫切需要,為企業(yè)種子質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)保障,防止純度不合格種子流入市場(chǎng),有效維護(hù)種子企業(yè)誠信品牌和良好形象,進(jìn)而增強(qiáng)企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭力。

表1 不同水稻品種室內(nèi)純度檢測(cè)與田間鑒定結(jié)果對(duì)比

傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定雖然是國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法,也是目前公認(rèn)的最準(zhǔn)確、可靠的方法,但由于其耗時(shí)費(fèi)力、鑒定周期長,導(dǎo)致鑒定結(jié)果常滯后于種子銷售,因而不適應(yīng)于種子銷售企業(yè)。SSR分子標(biāo)記鑒定具備標(biāo)記數(shù)量眾多、提供的信息量大,檢測(cè)程序簡單、費(fèi)用低,且不受外界環(huán)境因素影響,便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn),非常適用于大規(guī)模的種子純度快速檢測(cè)。選用多態(tài)性高的引物,可有效提高工作效率,降低成本。因此,應(yīng)繼續(xù)開發(fā)新的多態(tài)性高的SSR引物,且引物應(yīng)盡量均勻分布在染色體上,以便更全面地反映品種遺傳信息,使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

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(責(zé)任編輯：高 峻)

S 338

A

0528-9017(2015)05-0718-04

2015-03-26

浙江省重大專項(xiàng)(2013c02005)

曹棟棟(1983-),男,浙江寧波人,助理研究員,博士,從事種子生理生化、種子質(zhì)量研究及種子推廣工作。E-mail: jellycao@163.com。