劉文輝 黃曉璐 李海洲 余慶雄 梁筱 周怡雯 李青峰

皮膚擴張急性期miRNA表達譜的變化及關鍵miRNA的篩選

劉文輝 黃曉璐 李海洲 余慶雄 梁筱 周怡雯 李青峰

目的明確擴張急性期miRNA表達譜的變化，篩選出其中的關鍵miRNA。方法建立大鼠皮膚擴張模型，在擴張急性期取材，以未擴張皮膚為對照，利用miRNA芯片檢測miRNA表達譜的變化，并利用t檢驗和差異表達的倍數變化，篩選出關鍵miRNA。利用TargetScan和miRDB數據庫預測關鍵miRNA的靶點，并通過KEEG和IPA數據庫對預測靶點進行通路分析，以探究關鍵miRNA調控皮膚擴張急性期的可能機制。結果本研究篩選出11個關鍵miRNA，這些關鍵miRNA調控多個與增殖分化、血管化、纖維化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的通路。結論本研究篩選出皮膚擴張急性期的11個關鍵miRNA，調控擴張過程中多個重要通路的變化，可以作為調控皮膚擴張的靶點。

皮膚擴張小分子核糖核酸通路分析

皮膚軟組織擴張術是整復外科的重要手段。然而常規(guī)擴張?zhí)峁┑钠つw有限，不能滿足大面積缺損修復的需要。因此，促進皮膚的再生能力，提高擴張效率，一直是整復外科的研究熱點之一。目前，有研究認為罌粟堿[1-2]、雌三醇[3]、A型肉毒毒素[4]、二甲亞砜[5]、堿性成纖維細胞生長因子[6]、鈣通道阻滯劑[7]和骨髓間充質干細胞[8]等能夠提高擴張效率，但由于毒副作用、維持時間、給藥途徑等因素，而使其應用受到限制。臨床上尚缺乏能有效促進皮膚再生并提高擴張效率的方法。盡管已從組織和細胞水平上詳細了解了擴張過程中機體的各種變化，但基因水平上尚缺乏系統(tǒng)全面的認識，不能明確擴張過程中的關鍵分子，并針對這些關鍵分子實行有效的干預。

microRNA（miRNA）是體內一類重要的轉錄后調節(jié)非編碼RNA。盡管哺乳動物中編碼miRNA的基因僅占整個基因組的1%～5%，卻可能調控著超過1/3的人類基因[9]。目前已經發(fā)現(xiàn)超過上千種miRNA，調控分化、增殖、凋亡等生理過程[10]，miRNA的組織/細胞特異性表達、靶向調節(jié)和給藥方式多樣等特性使其成為理想的疾病診斷標志和治療靶點[11-12]。然而，擴張過程中miRNA的變化尚未見報道，明確這些變化將有助于加深對擴張過程中各種變化的理解，從而為提高擴張效率提供新的思路。

在皮膚擴張的不同階段，隨著炎癥、血流動力學和生物力學等因素的變化，細胞的生理狀態(tài)也在發(fā)生著變化。研究證實，擴張急性期中，機械張力能較快開啟增殖相關通路[13-16]，細胞的增殖能力也會迅速增強，然后逐漸恢復正常[17-18]。這種變化趨勢表明，擴張急性期有可能包含皮膚再生的關鍵變化，因此有必要對擴張急性期的各種變化加以明確。本研究的目的是明確擴張急性期中miRNA的變化，找出其中的關鍵miRNA，并對其功能進行生物信息學分析，為進一步的干預實驗篩選靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

雄性SD大鼠（我院SPF級動物實驗中心），7～8周齡；20 mL皮膚軟組織擴張器（廣州萬和整形材料有限公司）；RNA提取試劑盒（上海信帆生物科技有限公司）；miRNA芯片采用Affymetrix microRNA 3.0基因芯片平臺（上海伯豪生物技術有限公司）。

1.2 建立擴張模型

將3只SD大鼠腹腔內注射麻醉，背側皮膚備皮。麻醉后，在大鼠頸部后方作3 cm切口，切開皮膚、皮下至深筋膜淺層。然后向頭側及尾側剝離形成腔隙。其中尾側剝離范圍為3 cm×6 cm。向頭側腔隙中放置擴張器注射壺，并將擴張器植入尾側剝離腔隙，術畢，縫合切口。術后1周待切口愈合后，向擴張器內注入40 mL無菌生理鹽水。

1.3 RNA提取

注水2 h后，麻醉實驗動物，背部皮膚備皮，標記擴張皮膚中心區(qū)域（約2 cm×2 cm），快速抽走擴張器內無菌生理鹽水，捏起擴張皮膚，在標記區(qū)域附近作切口，迅速剪下標記區(qū)域皮膚，另在背部未擴張區(qū)域剪下相同大小的皮膚作為對照。將取下的皮膚在冰上勻漿，并用總RNA提取試劑盒提取皮膚標本中的RNA。

1.4 miRNA芯片

將RNA樣本提交給上海伯豪生物技術有限公司，委托其進行miRNA芯片的雜交、數據讀取和正態(tài)化工作。

1.5 差異miRNA篩選和靶點預測

對擴張與未擴張皮膚的miRNA表達數據進行雙尾t檢驗，P＜0.05的基因為差異表達的miRNA，并計算其在擴張與未擴張皮膚中差異表達的倍數變化。差異表達倍數達到1.5倍的即為關鍵miRNA。然后利用TargetScan（www.targetscan.org）和miRDB（mirdb.org/miRDB）數據庫，分別對篩選出的關鍵miRNA進行靶點預測，取兩者的交集作為預測靶點進行下一步分析。

1.6 miRNA靶點的通路分析

對預測出的miRNA靶點，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEEG）數據庫和Ingenuity Pathway Analysis（IPA，www.ingenuity.com）數據庫進行通路分析，明確這些靶點所涉及的生理功能和通路。

2 結果

2.1 差異miRNA

擴張與未擴張皮膚差異表達的miRNA共有41個，其中表達倍數變化超過1.5倍的有11個（表1）。

2.2 miRNA靶點預測

對篩選出的miRNA進行靶點預測（表1），除rno-miR-184和rno-miR-702-5p外，其余關鍵miRNA預測出的靶點較多，提示其調節(jié)的細胞功能較廣泛。

2.3 miRNA靶點的通路分析

利用KEEG數據庫和IPA數據庫對miRNA靶點進行通路分析。KEEG（圖1A）的結果表明，篩選出的11個miRNA調控了Wnt和MAPK等通路。IPA（圖1B）的分析結果表明，11個miRNA參與了FGF、EGF、NF-κB、ERK/MAPK、EMT、PDGF、VEGF和TGF-β等通路的調節(jié)。

圖1 miRNA靶點的通路分析結果Fig.1 Pathway analysis results of miRNA targets

表1 皮膚擴張前后差異表達的miRNATable 1 Differentially expressed miRNAs after skin expansion

3 討論

本研究首次明確了皮膚擴張急性期miRNA表達譜的變化，從中篩選出了11個差異表達倍數變化較大的miRNA，并通過這對些關鍵miRNA調節(jié)的靶點進行生物信息學分析，明確了這些miRNA可能調節(jié)的生理功能。

通路分析的結果表明，11個miRNA參與調控了Wnt、MAPK、FGF、EGF、NF-κB、ERK/MAPK、EMT、PDGF、VEGF和TGF-β等通路，這些通路在細胞增殖分化、血管化、纖維化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中都起到了重要的作用，表明這11個miRNA通過對其靶點的調控，能廣泛地影響皮膚的再生能力。因此，這11個皮膚急性擴張期的關鍵miRNA可作為未來實驗的干預靶點。

Dharap等[19]發(fā)現(xiàn)，在大腦的缺血預處理模型中，miR-485、miR-331和miR-21都有顯著的差異表達，說明這3個miRNA在組織的缺血適應中起到了一定的作用。Redova等[20]同樣證實了miR-21在缺氧狀態(tài)下的差異表達。而本研究也發(fā)現(xiàn)這3個miRNA有著顯著的差異表達。因擴張過程中皮膚處于相對缺血缺氧的狀態(tài)，因此這3個miRNA可能參與了皮膚對這種相對缺血缺氧狀態(tài)的適應過程。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，關鍵miRNAs調控了VEGF通路的功能，這有可能是皮膚適應相對缺血狀態(tài)的關鍵機制之一。

Liu等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-21與TGF-β1相互調節(jié)，并且兩者間存在正反饋作用；Bronnum等[22]發(fā)現(xiàn)，miR-21具有調節(jié)EMT的作用，這和本研究通路分析的結果是一致的。由于TGF-β對成纖維細胞、角質細胞和多種炎癥細胞存在廣泛的作用[23]，而EMT在多種纖維化疾病中也具有重要的作用[24-25]，因此miR-21可能通過對TGF-β和EMT的調控對皮膚擴張進行調節(jié)。另外，Gabriely等[26]認為，miR-21具有調控基質金屬蛋白酶家族（MMPs）的作用，而MMPs參與了NF-κB[27]、ERK[28]和EMT[25，29]等通路的調節(jié)，并且在膠原沉積和組織重塑中發(fā)揮著重要作用[30]。因此，MMPs是也可能是miR-21調控皮膚擴張的重要中間分子之一。

本研究尚存在一定的局限。由于皮膚擴張是一個長期的過程，在擴張的不同階段，隨著炎癥、血流動力學和生物力學等因素的變化，細胞的生理狀態(tài)存在著不同的變化。因此，要明確擴張過程中的各種變化，需要一系列時間序列的基因芯片數據，未來的研究將會著力于完善相關數據，明確擴張過程中miRNA表達譜的變化，并追蹤本研究發(fā)現(xiàn)的11個關鍵miRNA的變化趨勢，從而進一步明確11個關鍵miRNA調控皮膚擴張的機制。

本研究首次明確了皮膚擴張急性期miRNA表達譜的變化，有助于在基因水平上加深我們對擴張過程中各種變化的理解。本研究同時篩選出了11個關鍵miRNA，并利用生物信息學方法發(fā)現(xiàn)它們調控多個影響皮膚再生能力的重要通路。因此，這11個關鍵miRNA可作為調控皮膚擴張的靶點，指導進一步的實驗研究。

[1]Tang Y,Luan J,Zhang X.Accelerating tissue expansion by application of topical papaverine cream[J].Plast Reconstr Surg, 2004,114(5):1166-1169.

[2]Lee P,Squier CA,Bardach J.Enhancementoftissue expansion by anticontractile agents[J].Plast Reconstr Surg,1985,76(4):604-610.

[3]Tercan M,Cokkeser Y,Ozyazgan I,et al.Facilitated tissue expansion with topical estriol[J].Ann Plast Surg,2001,46(6):617-620.

[4]Chenwang D,Shiwei B,Dashan Y,et al.Application of botulinum toxin type A in myocutaneous flap expansion[J].Plast Reconstr Surg,2009,124(5):1450-1457.

[5]Raposio E,Santi PL.Topical application of DMSO as an adjunct to tissue expansion for breast reconstruction[J].Br J Plast Surg, 1999,52(3):194-197.

[6]胡亞蘭,郭樹忠,晏培松,等.堿性成纖維細胞生長因子和硫糖鋁聯(lián)合局部應用對擴張皮膚組織結構的影響[J].中國修復重建外科雜志,2002,16(5):340-344.

[7]Copcu E,Sivrioglu N,Sisman N,et al.Enhancement of tissue expansion by calcium channel blocker:A preliminary study[J]. World J Surg Oncol,2003,1(1):19.

[8]Yang M,Li QF,Sheng LL,etal.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells transplantation accelerates tissue expansion by promoting skin regeneration during expansion[J].Ann Surg,2011,253(1): 202-209.

[9]Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[10]Zhang B,Wang Q,Pan X.MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants[J].J Cell Physiol,2007,210(2):279-289.

[11]Shukla GC,Singh J,Barik S.MicroRNAs:processing,maturation, target recognition and regulatory functions[J].Mol Cell Pharmacol, 2011,3(3):83-92.

[12]Love TM,Moffett HF,Novina CD.Not miR-ly small RNAs:Big potential for microRNAs in therapy[J].J Allergy Clin Immunol, 2008,121(2):309-319.

[13]Yano S,Komine M,Fujimoto M,et al.Mechanical stretching in vitro regulates signal transduction pathways and cellular proliferation in human epidermal keratinocytes[J].J Invest Dermatol,2004,122 (3):783-790.

[14]Hofmann M,Zaper J,Bernd A,et al.Mechanical pressureinduced phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase in epithelial cells via Src and protein kinase C[J].Biochem Biophys Res Com,2004,316(3):673-679.

[15]Takei T,Rivas-Gotz C,Delling CA,et al.Effect of strain on human keratinocytes in vitro[J].J CellPhysiol,1997,173(1):64-72.

[16]Pietramaggiori G,Liu P,Scherer SS,et al.Tensile forces stimulate vascular remodeling and epidermal cell proliferation in living skin[J].Ann Surg,2007,246(5):896-902.

[17]Olenius M,Dalsgaard CJ,Wickman M.Mitotic activity in expanded human skin[J].Plast Reconstr Surg,1993,91(2):213-216.

[18]Austad ED,Thomas SB,Pasyk K.Tissue expansion:dividend or loan[J]?Plast Reconstr Surg,1986,78(1):63-67.

[19]Dharap A,Vemuganti R.Ischemic pre-conditioning alters cerebral microRNAs that are upstream to neuroprotective signaling pathways [J].J Neurochem,2010,113(6):1685-1691.

[20]Redova M,Svoboda M,Slaby O.MicroRNAs and their target gene networks in renal cell carcinoma[J].Biochem Biophy Res Com, 2011,405(2):153-156.

[21]Liu G,Friggeri A,Yang Y,et al.miR-21 mediates fibrogenic activation of pulmonary fibroblasts and lung fibrosis[J].J Exp Med,2010,207(8):1589-1597.

[22]Bronnum H,Andersen DC,Schneider M,et al.miR-21 promotes fibrogenic epithelial-to-mesenchymal transition of epicardial mesothelialcells involving Programmed Cell Death 4 and Sprouty-1[J].PLoS One,2013,8(2):e56280.

[23]Hotz B,Visekruna A,Buhr HJ,et al.Beyond epithelial to mesenchymal transition:a novel role for the transcription factor Snail in inflammation and wound healing[J].J Gastrointest Surg, 2010,14(2):388-397.

[24]Lee JM.The epithelial-mesenchymal transition:new insights in signaling,development,and disease[J].J Cell Biol,2006,172(7): 973-981.

[25]Lee K,Nelson CM.New insights into the regulation of epithelialmesenchymal transition and tissue fibrosis[J].Int Rev Cell Mol Biol,2012,294:171-221.

[26]Gabriely G,Wurdinger T,Kesari S,et al.MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators [J].Mol Cell Biol,2008,28(17):5369-5380.

[27]Okamoto H,Yoshio T,Kaneko H,et al.Inhibition of NF-kappaB signaling by fasudil as a potential therapeutic strategy for rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2010,62(1):82-92.

[28]Pillinger MH,Rosenthal PB,Tolani SN,et al.Cyclooxygenase-2-derived E prostaglandins down-regulate matrix metalloproteinase-1 expression in fibroblast-like synoviocytes via inhibition of extracellular signal-regulated kinase activation[J].J Immunol, 2003,171(11):6080-6089.

[29]Nelson CM,Khauv D,Bissell MJ,et al.Change in cell shape is required for matrix metalloproteinase-induced epithelialmesenchymal transition of mammary epithelial cells[J].J Cell Biochem,2008,105(1):25-33.

[30]Shuman Moss LA,Jensen-Taubman S,Stetler-Stevenson WG. Matrix metalloproteinases:changing roles in tumor progression and metastasis[J].Am J Pathol,2012,181(6):1895-1899.

miRNA Expression and Key miRNA Screening in Acute Stage of Skin Expansion

LIU Wenhui,HUANG Xiaolu,LI Haizhou,YU Qingxiong,LIANG Xiao,ZHOU Yiwen,LI Qingfeng.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn).

Objective To determine the miRNA expression and screen key miRNA in acute stage of skin expansion. Methods Skin expansion model was established and skin samples were harvested in acute stage.Unexpanded skin was also harvested as control.miRNA microarray was undertaken to reveal the miRNA expression change during acute expansion process.T test and fold change of differential expression were applied to screen key miRNAs.TargetScan and miRDB were used to predict target genes of key miRNA.Pathway analysis was performed for target genes by KEEG and IPA.Results Eleven key miRNAs were detected which regulate pathways involve cell proliferation,differentiation,vascularization,fibrosis and tumorigenesis.Conclusion Eleven key miRNAs determined in the present study regulate important pathways in acute stage of skin expansion and they could serve as targets in skin expansion.

Skin expansion;MicroRNA;Pathway analysis

R622

A

1673－0364（2015）01－0010－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.01.003

2015年1月10日；

2015年1月30日）

國家自然科學基金（No：81230042）。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。