張 薇，徐長君，吳 楊，劉超群

（大慶師范學(xué)院黑龍江大慶 163712）

采油污水對(duì)斑馬魚POD酶的影響

張 薇，徐長君*，吳 楊，劉超群

（大慶師范學(xué)院黑龍江大慶 163712）

為了研究采油污水對(duì)水生動(dòng)物的毒性效應(yīng)，以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)材料，將采油污水分別稀釋為1.5%，1.9%，3.0%的濃度梯度，利用提取酶液技術(shù)和比色法，檢測(cè)經(jīng)采油污水處理的斑馬魚頭部、肌肉、內(nèi)臟的過氧化物酶（POD）酶活性，進(jìn)而確定不同濃度的采油污水對(duì)斑馬魚POD酶活性的影響。結(jié)果顯示，頭部對(duì)照組POD酶活性為0.64 U·mg_1，1/4致死濃度組POD酶活性為0.8 U·mg_1，半致死濃度組POD酶活性為1.76 U· mg_1，全致死濃度組POD酶活性為2.4 U·mg_1；肌肉對(duì)照組和內(nèi)臟對(duì)照組情形與此相似。結(jié)論是隨著采油污水濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶增多，斑馬魚體內(nèi)POD酶活性變大說明采油污水已對(duì)斑馬魚產(chǎn)生了毒性影響。為此必須嚴(yán)密關(guān)注采油污水的處理工作，以防造成環(huán)境污染。

采油污水；斑馬魚；POD酶；急性毒性；吸光值

過氧化物酶體含有豐富的酶類，主要是過氧化物酶，過氧化氫酶和氧化酶。過氧化物酶體普遍存在于真核生物的各類細(xì)胞中，在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中數(shù)量尤其多。過氧化物酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶［1］，主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫、氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。過氧化物酶體的標(biāo)志酶是過氧化氫酶，它的作用主要是將過氧化氫（H2O2）水解。對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。

采油污水是伴隨石油開采過程中產(chǎn)生的廢水。其水質(zhì)具有以下幾方面特點(diǎn)：含油量遠(yuǎn)高于各種回用所要求的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；富含有機(jī)物；含有大量離子，其中既有成垢離子，又有腐蝕性的離子。采油污水外排時(shí)進(jìn)入水體后的危害是多方面的：如在水上形成油膜，能阻礙水體復(fù)氧作用，油類粘附在魚鰓上，可使魚窒息；粘附在藻類、浮游生物上，可使它們死亡；抑制水鳥產(chǎn)卵和孵化，嚴(yán)重時(shí)使鳥類大量死亡；還能使水產(chǎn)品質(zhì)量降低。

水環(huán)境是大部分污染物的最終匯集場(chǎng)所，也是水生動(dòng)物賴以生存的環(huán)境，研究典型環(huán)境污染物對(duì)魚類的毒性效應(yīng)［2_4］不僅可以較早發(fā)現(xiàn)污染物的危害并評(píng)價(jià)環(huán)境的質(zhì)量，而且可以預(yù)測(cè)其對(duì)陸生動(dòng)物甚至人類可能產(chǎn)生的后果，這對(duì)于保護(hù)水環(huán)境和水生資源、保障人類健康、建設(shè)和諧礦區(qū)均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義［5］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚的選取

實(shí)驗(yàn)用魚為斑馬魚，購于大慶讓胡路區(qū)博奧國際花鳥魚市場(chǎng)。在同一實(shí)驗(yàn)中要求試驗(yàn)魚，必須同屬、同種、同齡、盡量相同大小。魚的平均體長2 cm為合適。同組魚中最大體長不超過最小體長的1.5倍。選擇體色光澤、魚鰭完整舒展、行動(dòng)活潑、逆水性強(qiáng)、大小無太大懸殊、無任何疾病的魚作為試驗(yàn)魚。任何畸形魚、外觀上反常態(tài)的魚都不得用作試驗(yàn)魚。魚類行為是魚類對(duì)外界環(huán)境和體內(nèi)環(huán)境變化的外在反應(yīng)，包括游泳、攝食、生殖、呼吸以及避敵、攻擊、求偶時(shí)改變體色等［6］。

1.2 實(shí)驗(yàn)用采油污水的配制

采油污水來自于大慶師范學(xué)院微生物驅(qū)油研究室所贈(zèng)送。取適量采油污水，將其用8層紗布進(jìn)行過濾，濾掉雜質(zhì)及異物，并假設(shè)經(jīng)過濾后的污水濃度為單位1，向其中加去離子水稀釋，得到濃度分別為0.1，0.4，0.7，1.0，1.3，1.6等6個(gè)濃度梯度［7_8］（每個(gè)濃度設(shè)置1個(gè)平行組）。

1.2.1 試劑

0.05 mol·L_1pH值7.8磷酸緩沖液。取0.1 mol·L_1pH值7.8的磷酸鈉緩沖液50 mL，移入100 m L容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。石英砂?.05 mol·L_1愈創(chuàng)木酚（C7H8O2別名2-甲氧基酚，鄰甲氧基酚，甲基兒茶酚）溶液。2%雙氧水溶液。蒸餾水。

1.2.2 采油污水對(duì)斑馬魚的致死和半致死濃度

用1 000 mL燒杯分別盛裝上述濃度的采油污水。另取2個(gè)1 000 m L燒杯，盛裝靜置1周的自來水作為對(duì)照組。試驗(yàn)溶液調(diào)節(jié)至相應(yīng)溫度后，從馴養(yǎng)魚群中隨機(jī)取斑馬魚并迅速放入各試驗(yàn)容器中，每個(gè)容器放入8條。以96 h為一個(gè)試驗(yàn)周期，在24，48，72和96 h時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)魚的死亡數(shù)，確定斑馬魚的致死濃度和半致死濃度范圍［9］，如果沒有任何肉眼可見的運(yùn)動(dòng)，如鰓的扇動(dòng)、碰觸尾柄、魚鰭后無反應(yīng)等，即可判斷該魚已死亡。

根據(jù)致死濃度和半致死濃度范圍，再將此濃度分成6個(gè)濃度梯度，進(jìn)一步縮小濃度范圍，最終確定斑馬魚的1/4致死濃度、半致死濃度和致死濃度。

1.2.3 酶液提取

分別取0.4 g材料（頭部、肌肉、尾部）于預(yù)冷的研缽中，加入8 m L預(yù)冷的0.05 mol·L_1磷酸緩沖液（pH值7.8）（先加2 m L，在冰浴下研磨成勻漿后，將勻漿轉(zhuǎn)入10 m L離心管，再用6 m L沖洗），10 000 r·m in_1離心15 min，取上清液［10］定容至10 m L后于4℃保存。上清液用于過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定。

1.2.4 愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性

設(shè)置3組待測(cè)濃度分別為致死濃度、半致死濃度和1/4致死濃度，再設(shè)置一個(gè)對(duì)照組，按表1加入各溶液。將上述各試管立即放入預(yù)先調(diào)好37℃的水浴鍋中保溫5 min以上（酶促反應(yīng)），向?qū)φ展苤屑尤?.1 m L酶液，混勻，在λ470 nm處調(diào)零，再向測(cè)定管中加入0.1 m L酶液，并且立即計(jì)時(shí)，混勻后進(jìn)行比色測(cè)定，3 min時(shí)立即讀取吸光度［11］。

各反應(yīng)體系中試劑用量：對(duì)照組0.05 mol· L_1pH值5.5（7.8）磷酸緩沖液2.9 m L，2%雙氧水溶液0 m L，0.05 mol·L_1愈創(chuàng)木酚溶液1.0 m L，蒸餾水3.0 m L；1/4致死組0.05 mol·L_1pH值5.5（7.8）磷酸緩沖液2.9 m L，2%雙氧水溶液1.0 m L，0.05 mol·L_1愈創(chuàng)木酚溶液1.0 m L，蒸餾水2.0 m L；1/2致死組0.05 mol·L_1pH值5.5（7.8）磷酸緩沖液2.9 m L，2%雙氧水溶液1.0 mL，0.05 mol·L_1愈創(chuàng)木酚溶液1.0 m L，蒸餾水2.0 mL；全致死組0.05 mol·L_1pH值5.5（7.8）磷酸緩沖液2.9 m L，2%雙氧水溶液1.0 m L，0.05 mol·L_1愈創(chuàng)木酚溶液1.0 m L，蒸餾水2.0 m L。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以ΔD470·g_1（鮮重）·min_1表示。也可以用每分鐘內(nèi)D470變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位（U）表示。酶活性/（U·mg_1）=ΔD470×酶提取液總量/（樣品鮮重×測(cè)定時(shí)酶液用量）。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸光度和POD酶活力

不同濃度采油污水處理后斑馬魚組織提取液的吸光度值見表1。

通過表1可見，采油污水在同一濃度下，隨著處理時(shí)間由1 m in到2 min再到3 min，無論是頭部、肌肉、還是內(nèi)臟的吸光值都在增加。

表1 處理后斑馬魚體內(nèi)的吸光值

2.2 POD酶活力

POD酶活力檢測(cè)值見表2。

表2 處理后斑馬魚體內(nèi)POD酶活力

通過表2可見，隨著采油污水濃度的增大，頭部、肌肉、內(nèi)臟的吸光值也在增加。隨著采油污水濃度的升高，POD酶活性明顯增強(qiáng)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同的處理時(shí)間和環(huán)境條件下，隨著實(shí)驗(yàn)組設(shè)置的采油污水濃度的逐步增加，存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中的過氧化物酶就增多，斑馬魚體內(nèi)（頭部、肌肉、內(nèi)臟）POD酶活性就會(huì)隨之變大。這說明采油污水的毒性已對(duì)斑馬魚的生理產(chǎn)生影響。而且采油污水濃度的增大對(duì)斑馬魚的影響也隨之增大，最終使斑馬魚死亡。

3 小結(jié)

隨著采油污水濃度的升高，斑馬魚的POD酶活性也隨之增強(qiáng)，說明采油污水對(duì)斑馬魚的危害情況隨其濃度的增加而逐漸增大。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步判斷采油污水的毒性大小。過氧化物酶體普遍存在于真核生物的各類細(xì)胞中，但在肝細(xì)胞和腎細(xì)胞中數(shù)量特別多，所以，相對(duì)于頭部和肌肉，內(nèi)臟的POD酶的活性更大。

水是人類賴以生存的寶貴資源。大慶油田是我國目前最大的油田，也是世界上為數(shù)不多的特大型砂巖油田之一。在采油的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的采油污水，油田采油污水成分較復(fù)雜，含有的苯和萘等有毒物質(zhì)［12］，嚴(yán)重影響水生生物及植被，這將直接威脅到人類的身體健康。

生物監(jiān)測(cè)［13］是利用生物組分、個(gè)體、群體或群落對(duì)環(huán)境污染或變化所產(chǎn)生的反應(yīng)來闡明污染狀況，從生物學(xué)角度為環(huán)境質(zhì)量的監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)提供依據(jù)［14］。

大慶是綠色油化之都，天然百湖之城。伴隨著原油儲(chǔ)量的日漸減少，大慶肩負(fù)著由石油城向經(jīng)濟(jì)城、環(huán)保城以及向國際化大都市轉(zhuǎn)變的重任。良好的環(huán)境是大慶實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型的基礎(chǔ)。利用先進(jìn)的采油技術(shù)，提高石油采收率的同時(shí)，改善采油污水的處理方法，開發(fā)生物處理技術(shù)，減少有害污水的排放，妥善處理好采油污水，避免采油污水等對(duì)環(huán)境造成破壞，保持優(yōu)良的環(huán)境，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的偉大戰(zhàn)略構(gòu)想，為大慶建設(shè)百年油田貢獻(xiàn)力量。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

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0528-9017（2015）02-0285-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20150244

2014-09-24

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201310235021）

張 薇（1992_），女，黑龍江雙鴨山人，大慶師范學(xué)院生物科學(xué)系2011級(jí)學(xué)生。

徐長君。E-mail：1253122075@qq.com。

文獻(xiàn)著錄格式：張薇，徐長君，吳楊，等.采油污水對(duì)斑馬魚POD酶的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（2）：285_287.