李海濱孫煦勇秦 科鄧添薪趙國志黃程新覃音紅楊 柳

（1.中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州軍區(qū)器官移植中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

熒光素酶標(biāo)記人肝癌細(xì)胞的動物模型的建立

李海濱1孫煦勇1秦 科1鄧添薪2趙國志3黃程新1覃音紅1楊 柳1

（1.中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣州軍區(qū)器官移植中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

目的：利用熒光素酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞株HEPG2建立裸鼠肝原位移植動物模型。方法：裸鼠肝門靜脈接種1×106個細(xì)胞使其成瘤，經(jīng)活體熒光成像觀察腫瘤的生長情況。結(jié)果：利用熒光索酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HEPG2，成功建立了原位肝癌裸鼠模型。結(jié)論：利用熒光索酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HEPG2，可建立了原位肝癌裸鼠模型。小動物活體成像可為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術(shù)，為進(jìn)一步研究肝癌生長轉(zhuǎn)移機(jī)制和藥物開發(fā)提供了新的有用工具。

熒光素酶；肝癌；動物模型

生物發(fā)光成像是目前常用的活體成像技術(shù)之一，與其他影像學(xué)技術(shù)相比，熒光素酶發(fā)光的特點(diǎn)是在哺乳動物組織和細(xì)胞中的背景非常低小，細(xì)胞自身的內(nèi)源性光較低，穿透力強(qiáng)，具有更高的靈敏度，生物發(fā)光技術(shù)成像因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高，活體可在不同時間點(diǎn)觀察，從而減少實(shí)驗動物數(shù)量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物研究等領(lǐng)域[1,2]。本移植中心每年完成 30～50例肝移植患者中多數(shù)為肝癌患者，為更好地監(jiān)測轉(zhuǎn)染了抗癌基因的細(xì)胞植入體內(nèi)的動向及效果，給予患者有效的治療，本研究利用表達(dá)了熒光素酶的肝癌細(xì)胞株HEPG2建立了裸鼠肝原位移植動物模型。利用生物發(fā)光成像技術(shù)對此模型內(nèi)的腫瘤生長進(jìn)行非侵入性的連續(xù)監(jiān)測，同時評價生物發(fā)光成像在裸鼠肝原位移植模型建立中的作用，為肝癌生長轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究和藥物開發(fā)以及細(xì)胞治療提供有效手段。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞HEPG2由加拿大UBC大學(xué)戴龍君教授惠贈，L-谷氨酰胺(GIBICO公司)，雙抗(GIBICO公司)，DMEM (GIBICO公司)，胎牛血清（Hyclone公司），熒光素酶底物（Luciferin，Caliper Life Sciences），活體動物熒光成像系統(tǒng)（Lumazone，美國），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）。

1.1.2實(shí)驗動物

BALB/C裸鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心（實(shí)驗動物使用許可證SYXK桂2014-0003），鼠齡6周，體重18～21g，飼養(yǎng)在SPF飼養(yǎng)間。所有實(shí)驗動物的使用與實(shí)驗操作程序均經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)與解放軍第三〇三醫(yī)院實(shí)驗動物使用管理委員會批準(zhǔn)和實(shí)驗動物福利和倫理委員會的許可。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

采用DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，配成含10% 胎牛血清、100IU/ml 雙抗的培養(yǎng)液，同時設(shè)置兩孔標(biāo)記了熒光素酶的細(xì)胞與兩孔未標(biāo)記的細(xì)胞于96孔板，置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察

收集處于生長對數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，稀釋至2×106cells/ml，取250μl細(xì)胞懸液進(jìn)行肝門靜脈接種，共接種3只。每隔一周觀察一次，連續(xù)觀察四周，觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物(1μl/g)，戊巴比妥鈉(0．1 ml/g)麻醉后平放于活體熒光影像系統(tǒng)攝像，同時將在96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞分別加入熒光素底物后拍照，并用儀器自身所帶圖像分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在本實(shí)驗條件下生長良好，細(xì)胞呈梭形或多邊形，飽滿，貼壁生長（如圖1）。

圖1　HEPG2細(xì)胞

2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察

手術(shù)注射人肝癌細(xì)胞HEPG2后一周，2只小鼠死亡，成活1只。將余下1只小鼠麻醉后平放于活體熒光影像系統(tǒng)攝像，發(fā)現(xiàn)裸鼠肝臟出現(xiàn)米粒大小的腫瘤病灶，后面幾次略有增大。培養(yǎng)的細(xì)胞中加入熒光素底物后拍照可見細(xì)胞出現(xiàn)熒光（如圖2）。

圖2　肝癌原位移植模型與細(xì)胞的熒光觀察

3 討論

報告基因(reporter gene)是一組編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，其與目的基因融合后的表達(dá)產(chǎn)物可用來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控[3-5]。生物發(fā)光成像是目前常用的活體成像技術(shù)之一，與其他影像學(xué)技術(shù)相比，熒光素酶發(fā)光的特點(diǎn)是在哺乳動物組織和細(xì)胞中的背景非常低小，細(xì)胞自身的內(nèi)源性光較低，穿透力強(qiáng)，具有更高的靈敏度，生物發(fā)光技術(shù)成像因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高，活體可在不同時間點(diǎn)觀察，從而減少實(shí)驗動物數(shù)量，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物研究等領(lǐng)域?；铙w成像技術(shù)是目前廣泛用于腫瘤轉(zhuǎn)移、基因治療、干細(xì)胞示蹤、白血病等相關(guān)領(lǐng)域的研究，因此利用Luciferase標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行小動物活體成像能夠更有效地觀察腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程及評價治療效果[6,7]。

小動物成像技術(shù)對能檢測的腫瘤動物模型微小病灶的檢測靈敏度極高，能夠無創(chuàng)、實(shí)時、動態(tài)的動物活體觀察，從而對同一對象進(jìn)行不同時間點(diǎn)的觀察，減少實(shí)驗動物個體間差異，與傳統(tǒng)的方法相比，可大大減少實(shí)驗動物的用量，同時符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則，已成為廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域[8]。

本實(shí)驗利用熒光素酶基因標(biāo)記人肝癌細(xì)胞HEPG2，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克隆，經(jīng)過多次傳代表達(dá)水平穩(wěn)定，標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)、生長方式、生長速度及致瘤能力等與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯差異，可以反映HEPG2腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的標(biāo)記細(xì)胞。將其經(jīng)肝門靜脈接種裸鼠，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)能夠成瘤，并且腫瘤的體積與發(fā)光強(qiáng)度有相關(guān)性。手術(shù)時需注意不要將細(xì)胞漏到注射部位外，否則容易對成瘤的成像觀察造成影響。動態(tài)觀察4～6周后，可將成瘤動物安樂死，獲取病變組織，按病理程序嚴(yán)格操作留樣，相關(guān)研究結(jié)果將后續(xù)報道。

綜上所述，利用熒光素酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HEPG2成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小動物活體成像為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術(shù)，可為進(jìn)一步研究肝癌生長轉(zhuǎn)移機(jī)制和藥物開發(fā)以及細(xì)胞治療提供有效技術(shù)手段。

致謝

本研究得到了加拿大UBC大學(xué)的戴龍君教授的大力幫助，并無私贈送了HEP2細(xì)胞，在此表示感謝。

[1] 王一帆,夏睿,郭玉林,等.腺病毒介導(dǎo)熒光素酶報告基因感染間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志, 2013,33(6):473-477.

[2] 董苑,李彩霞,趙嫻,等.熒光素酶基因穩(wěn)定表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞系的構(gòu)建[J].中華顯微外科雜志,2014,(6): 569-572.

[3] 薛秀花,黃晨西.熒光素酶基因的研究進(jìn)展[J].生物學(xué)通報,2013,48(9):1-4.

[4] 張禾璇,單可人,官志忠.報告基因研究及其應(yīng)用進(jìn)展[J].國際遺傳學(xué)雜志,2013,36(1):6-12.

[5] Maita H,Tomita K,Ariga H. A split luciferase-based reporter for detection of a cellular macromolecular complex[J].Anal Biochem,2014,(452):1-9.

[6] 張金棟,呂景禮,李曉艷,等.整合熒光素酶的穩(wěn)定細(xì)胞克隆建立裸鼠肺癌靜脈移植瘤模型的探索[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(7):1055-1057.

[7] Lake M C,Aboagye E O.Luciferase fragment complementtation imaging in preclinical cancer studies[J].Oncoscience, 2014, 1(5):310-325.

[8] 李小穎,高凱,董偉,等.熒光素酶標(biāo)的人肝癌細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和PET-CT成像比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2011,(3):10-13.

Establishment of the animal model with human hepatoma cell labelled with luciferase

Objective:To establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase. Methods:1×106cells which constitutively expressing lueiferase were inoculated to liver of BALB／c-nu through hepatic portal vein for assessment of tumor growth with the whole-body optical imaging system.Results:Successfully establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase.Conclusion:Hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase can be successfully made,which is a new tool to further study the mechanism of metastasis and drug discovery.

Luciferase;hepatoma;animal model

R392.4

A

1008-1151(2015)06-0102-02

2015-05-12

廣西自然基金（2013gxnsfaa019253）；廣西科學(xué)技術(shù)開發(fā)與研究項目（桂科攻14124003-8）。

李海濱，男，中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗師，從事轉(zhuǎn)基因與克隆、分子生物學(xué)、移植免疫學(xué)研究。

孫煦勇，中國人民解放軍第三〇三醫(yī)院移植醫(yī)學(xué)研究院，廣西移植醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師。