王瑞霞

缺血性心臟病是當(dāng)今世界尤其是發(fā)展中國家致死率最高的人類疾病[1]，缺血心肌經(jīng)血運(yùn)重建后引起心肌細(xì)胞凋亡從而引發(fā)缺血再灌注損傷，目前尚無可靠的藥物進(jìn)行防治[2]。因此，開發(fā)保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的藥物已成為近年來研究的熱點(diǎn)。苦參堿類生物堿廣泛存在于豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait）、苦豆及廣豆根中，屬喹諾里西丁類（quinolizidines）。苦參堿在心血管領(lǐng)域有著廣泛的生物活性，大量研究表明苦參堿通過抑制心肌細(xì)胞凋亡可以減少缺血再灌注后的心肌細(xì)胞損傷，本研究將利用細(xì)胞急性缺氧復(fù)氧模型，模擬心肌缺血再灌注損傷，觀察苦參堿對(duì)急性缺氧復(fù)氧的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

H9c2細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒和活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）和 B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）一抗（英國ABCOM公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

H9c2細(xì)胞株在含10%胎牛血清高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)（條件為37℃，5%CO2），2～3 d傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：（1）對(duì)照組：不作任何處理；（2）缺氧復(fù)氧組（模型組）：將細(xì)胞放入缺氧箱中缺氧12 h，再復(fù)氧 6 h；（3）和（4）苦參堿處理組：用含10 μmol/L和30 μmol/L 苦參堿的 DMEM 完全培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞12 h，然后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板的H9c2細(xì)胞，接種密度為105/孔，每孔液體200 μL。實(shí)驗(yàn)處理后各組每孔加入 MTT 溶液（5 mg/ml）20 μL，孵育 4 h；去培養(yǎng)液，然后各組每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。設(shè)不加細(xì)胞只加孵育液的空白對(duì)照，記錄結(jié)果。細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值）×100%。

1.4 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取處理過的各組6孔培養(yǎng)板，先將可能含有漂浮凋亡細(xì)胞的各組培養(yǎng)液分別收集于流式管中，用0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集于對(duì)應(yīng)的流式管中，4℃、1 000 r/min離心5 min，用冰預(yù)冷的PBS洗滌2次，然后用200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，避光室溫反應(yīng)15 min，再加入10 μL PI避光室溫反應(yīng) 5 min或者 4℃反應(yīng)30 min，加入 250 μL PBS，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.5 Tunnel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)期生長的H9c2細(xì)胞以5×105個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，孔中置圓形蓋玻片，細(xì)胞貼壁后，常規(guī)培養(yǎng)4 d后將細(xì)胞按1.2方式進(jìn)行分組處理，處理后將蓋玻片取出，以PBS液洗滌，晾干，用多聚賴氨酸細(xì)胞面朝上粘于載玻片。PBS沖洗載玻片兩次，干燥樣品載玻片四周區(qū)域，每個(gè)樣品加入50 μL TUNEL混合液，注意加蓋封口膜或蓋玻片，37℃暗室孵育60 min，PBS沖洗載玻片3次，滴加1滴PBS，激發(fā)光 450～500 nm，檢測(cè)波長 515～565 nm，熒光顯微鏡下分析樣品，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。

1.6 SOD和MDA測(cè)定

上述處理過的細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 細(xì)胞中ROS檢測(cè)

生長狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，按1.2方式進(jìn)行分組處理。消化收集細(xì)胞。按照1：1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為100～2 000×104/ml，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。上機(jī)測(cè)試。

1.8 Western Blot檢測(cè) ASK1、JNK和 Bcl-2蛋白表達(dá)

按1.2方式處理過的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，收集細(xì)胞加入裂解緩沖液 4℃裂解20 min，收集細(xì)胞裂解液，離心，收集上清液。用Bradford法測(cè)定裂解液中總蛋白含量。取細(xì)胞裂解液上樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，每孔40 μg蛋白電泳。電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。加入封閉液過夜，抗靶蛋白抗體溶液4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗工作液室溫孵育1 h，洗膜，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)靶蛋白的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料為正態(tài)分布，用表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差具有齊性時(shí)用SNK檢驗(yàn)，方差不具有齊性時(shí)用Dunnett檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)缺氧復(fù)氧后H9c2細(xì)胞增殖的作用

與缺氧復(fù)氧組（47.7% ±3.4%）比較，苦參堿低劑量和高劑量處理組的細(xì)胞生存率顯著提高（59.3% ±3.1%和70.6% ±2.7%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。

2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式結(jié)果如圖1所示，與缺氧復(fù)氧組（67.4% ±6.8%）比較，苦參堿低劑量和高劑量處理組的細(xì)胞凋亡率明顯下降（34.6% ±4.2%和18.5% ±1.9%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。表明苦參堿具有抑制缺氧復(fù)氧的H9c2細(xì)胞凋亡的作用。

2.3 Tunnel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Tunnel法檢測(cè)結(jié)果與流式結(jié)果吻合，模型組凋亡細(xì)胞明顯增多，苦參堿處理組細(xì)胞凋亡較模型組顯著減少（圖2）。

2.4 SOD活性、MDA含量以及ROS檢測(cè)

氧化應(yīng)激系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組比較，模型組的SOD活性和ROS含量顯著降低，而與模型組比較，苦參堿低、高劑量組能顯著提高二者含量，并呈劑量依賴；與對(duì)照組比較，模型組的MDA含量顯著增多，而與模型組比較，苦參堿處理組能顯著減少M(fèi)DA含量。

2.5 Western Blot檢測(cè) ASK1、JNK和 Bcl-2蛋白表達(dá)

Western Blot結(jié)果如圖3、4所示，與對(duì)照組比較，模型組中ASK1和JNK蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)卻顯著升高，而苦參堿低、高劑量處理組均能提高ASK1、JNK的表達(dá)同時(shí)降低Bcl-2的表達(dá)。

圖1 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)法流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖2 鏡下觀察細(xì)胞凋亡（×200） 與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡明顯增加，而苦參堿有效抑制了細(xì)胞凋亡，并隨劑量的升高這種作用越強(qiáng)

表1 不同組別細(xì)胞中SOD、MDA及ROS檢測(cè)（）

表1 不同組別細(xì)胞中SOD、MDA及ROS檢測(cè)（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 MDA（nmol/mgprot）SOD（U/mgprot）FITC-A MEAN對(duì)照組 0.51±0.14 200.45±8.53 1 803±183模型組 2.17±0.19a 128.45±9.34a 935± 73a苦參堿低劑量處理組 1.14±0.21b 147.54±6.47b1 165±75b苦參堿高劑量處理組 0.83±0.14b 179.76±5.85b1 535±123b

圖3 Western Blot檢測(cè)ASK1、JNK和Bcl-2表達(dá)

圖4 ASK1、JNK和Bcl-2的蛋白表達(dá)量

3 討論

近年來，心血管疾病已成為危害人類健康的重要疾病，造成心肌和血管損傷的因素眾多[3]。缺血再灌注可誘發(fā)細(xì)胞凋亡[4]，心肌細(xì)胞凋亡與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。心肌再灌注損傷主要是氧供應(yīng)的恢復(fù)和大量ROS的爆發(fā)性增多造成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙，因此可以主要?dú)w結(jié)為心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的問題[5]。ROS是外源性氧化劑活細(xì)胞內(nèi)氧代謝產(chǎn)生的高生物活性的氧分子，生理狀態(tài)下，機(jī)體可以產(chǎn)生少量ROS，而機(jī)體內(nèi)具有SOD，可以分解ROS成分，以維持機(jī)體ROS的平衡[6]。在缺血再灌注時(shí)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，ROS大量產(chǎn)生，ROS堆積能激活線粒體上非特異MPTP開放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。

大量文獻(xiàn)表明，苦參堿在心血管系統(tǒng)具有廣泛的藥理活性，例如抗心律失常[8]。苦參堿可以抑制心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流，對(duì)大鼠急性心肌缺血具有保護(hù)作用[9]，可以減少自由基生成，減輕脂質(zhì)過氧化[10]。還可以通過抑制NO的過量生成，緩解炎癥反應(yīng)[11]。本實(shí)驗(yàn)建立了H9c2細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型模擬缺血再灌注損傷，結(jié)果顯示苦參堿對(duì)于缺氧復(fù)氧造成的損傷具有顯著的抑制作用，提高了H9c2細(xì)胞的存活率。在模型組中，ROS和MDA的含量比苦參堿處理組和對(duì)照組顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SOD的活性卻顯著降低。流式結(jié)果證實(shí)，苦參堿對(duì)于缺氧復(fù)氧引發(fā)的細(xì)胞凋亡同樣具有抑制作用，我們推測(cè)苦參堿主要是通過抑制凋亡來起到提高存活率的作用，而苦參堿可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，從而導(dǎo)致MDA含量也降低，同時(shí)提高SOD的活性，進(jìn)一步清除細(xì)胞內(nèi)的ROS。通過減少ROS產(chǎn)生消除堆積，抑制MPTP的開放，最終達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。

ROS與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[12]，其介導(dǎo)的JNK信號(hào)通路是JNK信號(hào)通路的重要成員之一，在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。ASK1是MAPKKK家族的成員之一，可以激活SEK1（MKK4）/MKK7-JNK 和MKK3/MKK6-p38MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)，而其本身又可被氧化應(yīng)激在內(nèi)的多種應(yīng)激而激活，有證據(jù)顯示，ROS可以通過去磷酸化激活[13]，也可以使PP5與ASK1結(jié)合而抑制ASK1活性，提示存在一種負(fù)向調(diào)控機(jī)制。我們通過Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組中ASK1和JNK蛋白都較苦參堿處理組高，而bcl-2蛋白表達(dá)降低，于是我們推測(cè)，苦參堿可能通過激活A(yù)SK1的表達(dá)，使JNK表達(dá)升高，抑制了Bcl-2蛋白表達(dá)，從而降低線粒體膜通透性和細(xì)胞色素C的釋放，抑制凋亡。

關(guān)于苦參堿作用的機(jī)制，我們僅僅是研究了其對(duì)于ASK1和JNK蛋白的影響，具體在JNK信號(hào)通路里是通過哪些蛋白逐步發(fā)揮抗凋亡作用還有待研究。我們希望苦參堿在將來能夠應(yīng)用于臨床，真正為患者提供幫助。