1.福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 2.福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心 3.福州鐵路公安處刑事技術(shù)支隊(duì)

王成艷1 趙東岳2 胡興亞3

腎小管間質(zhì)纖維化（Renal Interstitial Fibrosis, RIF）是由多種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）成分在腎間質(zhì)過(guò)度沉積，它幾乎是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)[1]。眾多細(xì)胞因子及致纖維化介質(zhì)參與了腎纖維化過(guò)程，但腎小管間質(zhì)纖維化的具體發(fā)生機(jī)制目前尚不十分明確，研究證實(shí)小管上皮-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）在腎間質(zhì)纖維化中發(fā)揮重要作用[2-4]，其中α-SMA是EMT的標(biāo)志蛋白[5]。E-cad 是腎小管上皮細(xì)胞表型特異性標(biāo)志物，研究證實(shí)，E-cad表達(dá)的下降在腎小管上皮轉(zhuǎn)分化過(guò)程中起重要作用[6]。

同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hcy)是蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物，是一種含硫氨基酸，Hcy在體內(nèi)以蛋白結(jié)合型和游離型兩種形式存在，通過(guò)腎臟代謝和排泄。目前Hcy在心血管疾病及神經(jīng)病變中研究較多，在腎臟病領(lǐng)域主要集中于血液透析患者。體內(nèi)體外的研究表明，Hcy與腎小球纖維化密切相關(guān)[7]，Hcy能顯著促進(jìn)腎小球細(xì)胞的增殖[8]，但 Hcy與腎間質(zhì)纖維化有無(wú)關(guān)系卻罕有報(bào)導(dǎo)。葉酸(Folic acid，F(xiàn)A)是B族維生素的一種，是蛋氨酸循環(huán)的重要輔助因子。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A能下調(diào)腎臟病變患者體內(nèi)Hcy的濃度[9]。

對(duì)于EMT是否參與Hcy誘導(dǎo)的腎間質(zhì)損傷以及葉酸能否對(duì)這一損傷有治療作用尚不可知。本研究通過(guò)口服蛋氨酸觀察是否造成腎間質(zhì)纖維化病變，并以腎小管上皮細(xì)胞HK-2為載體，觀察Hcy對(duì)其短期增殖以及細(xì)胞活力的影響，并檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)以研究EMT是否參與此過(guò)程，摸索建立新的大鼠腎間質(zhì)纖維化模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠24只，體重90 ~120g，清潔級(jí)，購(gòu)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為control組8只，蛋氨酸組8只，蛋氨酸＋葉酸組8只。

1.2 主要試劑

小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、小鼠抗人E-鈣連接蛋白單克隆抗體及小鼠抗人β-actin單克隆抗體，購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠抗體(Evision Two-Step? Anti-mouse Detection Reagent，HRP)，購(gòu)自 Antibody Diagnostica Inc；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO），購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；Masson三色染色試劑盒，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。CellTiter 96RAqueous One Solution試劑盒購(gòu)于Promega公司。

1.3 模型制備及樣本留取

大鼠分為對(duì)照組、蛋氨酸組、蛋氨酸＋葉酸組，每組8只。對(duì)照組：滅菌水溶液；蛋氨酸組、蛋氨酸＋葉酸組分別按1 g/kg·d、1 g/ kg·d Met +100 mg/ kg·d FA的劑量，每日灌胃1次，共120天。造模結(jié)束后留取腹主動(dòng)脈血，制備血漿，處死動(dòng)物。切取一側(cè)腎臟組織，稱重，-80℃保存；切取另一側(cè)腎臟的1/3用4%的中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血漿同型半胱氨酸濃度測(cè)定

全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)已制備的血漿中Hcy濃度。

1.5 Masson染色

石蠟切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟，按Masson三色染色試劑盒完成染色。

1.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖

收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以2×104/孔接種于96孔板，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞匯合度達(dá)70%以上時(shí)，加入不同濃度的Hcy或Hcy+ FA，處理68 h，每孔加入MTS/PMS(20:1)混合液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，繪制細(xì)胞生存曲線。

1.7 組織蛋白的提取

剪取一小塊腎臟組織，放入研缽內(nèi)，冰上研磨，加入適量RIPA裂解液裂解20 min，收集裂解液，4 ℃，14000 rpm × 10 min離心，取上清液。-80℃保存，Western blot法檢測(cè)E-cad的表達(dá)。

1.8 Western blot法檢測(cè)α-SMA、E-cad的表達(dá)

以2×105/mL的密度接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，以Hcy200，Hcy400，Hcy400 +不同濃度FA處理細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解，超聲破碎，Bio-RAD蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，跑SDS-PAGE，250mA恒流濕轉(zhuǎn)蛋白于NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，α-SMA一抗（1:200）或E-cad一抗（1:1000）孵育過(guò)夜后，回收一抗，PBST洗三次，二抗孵育1 h，PBS洗兩次，PBST洗一次，曝光。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠的體重測(cè)定

隨機(jī)分組后，每隔兩周測(cè)定大鼠的體重，記錄整理，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸組大鼠的體重較對(duì)照組有所降低（見(jiàn)圖1）。

圖1 各組大鼠體重變化圖

2.2 對(duì)照組、蛋氨酸組、蛋氨酸＋葉酸組血漿Hcy濃度測(cè)定

處死大鼠后，抽血制備血漿，通過(guò)生化分析儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸組能引起高同型半胱氨酸血癥，而蛋氨酸＋葉酸組卻能明顯降低血Hcy的濃度，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 血漿Hcy濃度測(cè)定

2.3 腎臟組織病理

造模結(jié)束后，行腎臟組織固定、切片，進(jìn)行Masson染色。光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠腎組織無(wú)明顯病理改變，蛋氨酸組可見(jiàn)間質(zhì)明顯的藍(lán)色沉積，蛋氨酸＋葉酸組可見(jiàn)較弱的間質(zhì)藍(lán)染。用Image-Pro Plus program 程序測(cè)定纖維化面積，以百分比表示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3）。

圖3 造模結(jié)束后，各組大鼠光鏡觀察腎間質(zhì)纖維化程度比較（×400）以及纖維化面積測(cè)定

2.4 E-cad在組織中的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，蛋氨酸組，蛋氨酸＋葉酸組腎臟組織中E-cad的表達(dá)顯著低于control組，見(jiàn)圖4。

圖4 組織中的表達(dá)

2.5 細(xì)胞活力的測(cè)定

MTS結(jié)果可見(jiàn)，Hcy能顯著增強(qiáng)HK-2細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性（圖5）。當(dāng)Hcy濃度達(dá)到400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力增強(qiáng)明顯（p<0.01），故選此濃度為實(shí)驗(yàn)濃度。

在400 μmol/L Hcy處理下，聯(lián)合不同濃度的FA處理，可見(jiàn)隨著FA作用量的加大，細(xì)胞活力逐漸下調(diào)（圖5）。

圖5 MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力

H400組與control組相比，p< 0.05；H400+F400組與H400組相比，p< 0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 Hcy濃度依賴性地下調(diào)E-cad、上調(diào)α-SMA的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，Hcy處理后，隨著劑量的增加，E-cad的表達(dá)逐漸下調(diào)（圖6）；而單用Hcy時(shí)，α-SMA的表達(dá)顯著增加，呈濃度依賴性（圖6）。

圖6 Western blot檢測(cè)HK-2細(xì)胞中E-cad、α-SMA的表達(dá)

2.7 FA抑制Hcy誘導(dǎo)的E-cad、α-SMA的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)A與Hcy聯(lián)合處理下，與Hcy 400 μmol/L相比，E-cad的表達(dá)在不同濃度FA刺激下又重新上調(diào)（圖6）；α-SMA蛋白水平則隨著FA濃度增加而不斷下調(diào)（圖6）。

3 討論

Hcy是致動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[10]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在慢性腎臟病患者中約80%存在不同程度的高半胱氨酸血癥，大約是正常人群的39倍[11]。研究顯示，口服蛋氨酸誘導(dǎo)的高同型半胱氨酸血癥可誘導(dǎo)腎小球纖維化，血中半胱氨酸的濃度可升至約30 μmol/L，而補(bǔ)充葉酸治療可減輕腎小球的損害，提示Hcy參與腎小球纖維化的過(guò)程[7]。Ingram等證實(shí)增加Hcy的水平最終能引起腎臟的硬化[12]，這一結(jié)果提示我們Hcy可能參與腎間質(zhì)損傷。我們給予口服蛋氨酸誘導(dǎo)的高同型半胱氨酸血癥可誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化，血中同型半胱氨酸的濃度可升至約25.95 μmol/L，而補(bǔ)充葉酸治療可減輕腎間質(zhì)的損害，提示Hcy參與腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到Hcy的水平與細(xì)胞活力的增強(qiáng)，α-SMA的表達(dá)增高以及E-cad的表達(dá)下調(diào)是一致的，而葉酸干預(yù)可以降低細(xì)胞活力和α-SMA的表達(dá)。故推測(cè)血漿Hcy參與腎小管間質(zhì)纖維化的機(jī)制如下：（1）Hcy促進(jìn)腎臟小管上皮細(xì)胞的不斷增殖，上皮細(xì)胞的活化產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），形成纖維化。（2）Hcy促進(jìn)腎小管- 間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化表達(dá)α-SMA且降低E-cad的表達(dá)，這是腎纖維化進(jìn)行性發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，α-SMA可作為評(píng)價(jià)腎小管-間質(zhì)損傷的細(xì)胞表型標(biāo)志和預(yù)后的標(biāo)志。

葉酸（Folic Acid, FA）又稱蝶酰谷氨酸，由喋啶核、對(duì)氨苯甲酸及谷氨酸三部分組成。葉酸是Hcy代謝途徑中蛋氨酸合成酶的輔助因子，是最有效降低Hcy水平的單一抑制劑[13]。故本實(shí)驗(yàn)選擇了葉酸作為干預(yù)藥物。本實(shí)驗(yàn)觀察到葉酸減低了血漿Hcy的水平，下調(diào)了α-SMA的表達(dá)，抑制了細(xì)胞增殖，減輕了腎纖維化的程度，進(jìn)一步提示我們血漿Hcy水平與間質(zhì)纖維化程度有關(guān)，其導(dǎo)致纖維化的機(jī)制與小管上皮細(xì)胞增殖及腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服蛋氨酸可以通過(guò)提高血漿Hcy水平來(lái)誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化，Hcy能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的增殖，推測(cè)Hcy導(dǎo)致腎損傷的一個(gè)可能的機(jī)制是α-SMA的過(guò)表達(dá)以及E-cad表達(dá)的進(jìn)行性減低，提示腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，最終導(dǎo)致EMT的發(fā)生。葉酸能有效保護(hù)Hcy誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖。

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