端正花，陳曉歐，劉靈麗，宮知遠(yuǎn)，李彩霞（.天津理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，天津 300384；.新加坡國立大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新加坡 7543）

苯并三唑和鎘對斑馬魚肝臟的聯(lián)合毒性效應(yīng)

端正花1*，陳曉歐1，劉靈麗1，宮知遠(yuǎn)2，李彩霞2（1.天津理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，天津 300384；2.新加坡國立大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新加坡 117543）

采用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）為模型，探討了環(huán)境中苯并三唑及其衍生物（BTRs）與重金屬鎘對斑馬魚的單獨(dú)與聯(lián)合肝臟毒性效應(yīng).結(jié)果表明，0.001～0.1μmol/L CdCl2單獨(dú)暴露使斑馬魚肝臟結(jié)合蛋白基因lfabp10a表達(dá)量增強(qiáng)，肝臟尺寸相對空白對照組顯著膨大（P＜0.005），而1μmol/L CdCl2顯著抑制斑馬魚lfabp10a的表達(dá)，肝臟尺寸相對空白對照組顯著降低（P＜0.005）.苯并三唑（1H-BTR，1H-benzotriazole）相對CdCl2而言毒性較低，5 μmol/L 1H-BTR暴露時斑馬魚肝臟lfabp10a表達(dá)量增強(qiáng)（P=0.000）.聯(lián)合暴露研究發(fā)現(xiàn)，1H-BTR能顯著降低重金屬鎘對斑馬魚的肝臟毒性.因此，苯并三唑在環(huán)境污染物毒性評價中具有重要意義.

苯丙三唑；鎘；轉(zhuǎn)基因斑馬魚；聯(lián)合毒性

苯并三唑及其衍生物（BTRs）在醫(yī)藥、農(nóng)藥、材料、生物染色劑和離子受體等多個領(lǐng)域具有廣泛的潛在應(yīng)用［1］.例如美國BTRs的平均總產(chǎn)量高達(dá)9000t/a［2］.由于其龐大的生產(chǎn)量及各種消費(fèi)和工業(yè)產(chǎn)品廣泛的使用，BTRs對環(huán)境的污染日益受到重視.Wang等［3］研究發(fā)現(xiàn)，美國和東亞地區(qū)的室內(nèi)灰塵總BTRs的濃度大約在20～90ng/g，而中國室內(nèi)灰塵中BTRs的濃度最高能達(dá)2000ng/g.世界范圍內(nèi)淡水和海洋環(huán)境中BTRs的總濃度約為0.08～200 μg/L［4］.BTRs的急性毒性較低，但是會產(chǎn)生各種慢性毒性［5］.研究發(fā)現(xiàn)1H-苯丙三唑（1H-benzotriazole，1H-BTR）具有發(fā)育毒性、致突變性和內(nèi)分泌干擾特性，并被列為環(huán)境可疑致癌物［6］.然而目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于此類化合物的環(huán)境污染和環(huán)境行為方面的系統(tǒng)研究報道［7］.

斑馬魚（Danio rerio）是環(huán)境毒理學(xué)中常用的標(biāo)準(zhǔn)生物模式種［8-9］，基因的保守性與人類基因組相比約為87％.在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展的轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)水產(chǎn)育種學(xué)等研究領(lǐng)域，在環(huán)境毒理學(xué)方面也有一定的價值.通過標(biāo)示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（nkx2.2a：EGFP）可以研究林丹等污染物的神經(jīng)毒性［10］.Nguyen利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚建立了一種可誘導(dǎo)肝癌模型Tg（kras（V12）：EGFP）［11］，該模型可以顯著表達(dá)外源化合物的致癌和抗癌性能，但是目前還未有環(huán)境致癌物檢測的相關(guān)嘗試.另外，某些特殊蛋白經(jīng)過熒光標(biāo)記后，可以在斑馬魚活體胚胎內(nèi)將它們作為靶分子檢測出來.例如通過標(biāo)示Cyp1a基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（cyp1a：EGFP）可以觀察到TCDD暴露下Cyp1a基因在斑馬魚體內(nèi)各個器官表達(dá)的影響［12］.轉(zhuǎn)基因斑馬魚檢測方法快捷簡單，在熒光顯微鏡下觀察計量即可，通常只需2min，而大多數(shù)傳統(tǒng)的檢測方法需要2d.這種檢測可以在活體上直接進(jìn)行，因此能夠觀察到在環(huán)境污染物干擾下某一個體在整個連續(xù)生命周期的發(fā)展變化，從而可以為其敏感性的研究提供直觀證據(jù).

肝臟是許多外源化學(xué)物毒作用的重要靶器官.依賴于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，建立標(biāo)示肝臟發(fā)育的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP），以紅色熒光標(biāo)記肝臟lfabp10a基因，可以直觀的在顯微鏡下觀察到環(huán)境污染物暴露下lfabp10a基因在肝臟表達(dá)的部位和表達(dá)量，從而表征肝臟可能的尺寸變化［13］.斑馬魚肝型脂肪酸結(jié)合蛋白相關(guān)基因lfabp10a是脂肪酸結(jié)合蛋白家族（L-FABP）的重要成員之一，L-FABP不但可轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸，為細(xì)胞生長提供能源及原材料，還可以結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)各種配體、參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、影響有絲分裂，同時還具有抗氧化的功能.馮愛娟等［14］研究發(fā)現(xiàn)，L-FABP的表達(dá)增強(qiáng)與脂肪肝的發(fā)生有顯著相關(guān)性.Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)對乙酰氨基酚、利福平、阿司匹林等肝臟細(xì)胞損傷毒性物質(zhì)的暴露與轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg（lfabp10a： dsRed；elaA： EGFP）肝臟熒光量表達(dá)的降低存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系.

在實際環(huán)境中，環(huán)境污染物不可能單獨(dú)存在，更多的是兩種或多種污染物同時共存于環(huán)境中，它們作用于生物體時往往會發(fā)生與單一污染物作用完全不同的聯(lián)合毒性作用.本研究以轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）為模型，擬建立快速而又特異性強(qiáng)的BTRs毒性檢測技術(shù)，并探討環(huán)境中BTRs與重金屬離子的聯(lián)合作用規(guī)律，以期為BTRs的健康風(fēng)險和生態(tài)風(fēng)險提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苯丙三唑（1H-benzotriazole，1H-BTR）和氯化鎘（CdCl2）（Sigma-Aldrich公司）.稱取一定量的上述粉末，加入少量無水EDTA助溶（實際暴露溶液中EDTA的濃度不超過0.01％，經(jīng)溶劑對照試驗，此濃度對試驗結(jié)果無影響），再溶于重組水［16］中，稀釋到需要的濃度.根據(jù)這兩種物質(zhì)在環(huán)境中的實際濃度和預(yù)實驗結(jié)果，本試驗中1H-BTR的暴露濃度為0.2，1，5μmol/L，Cd2+的暴露濃度為0.001，0.01，0.1，1μmol/L.

實驗室自培育成年野生斑馬魚和轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP），雌雄比1：2，每日喂食活鹵蟲芽苗（Aremia mauplii，World Aquafedds，USA）1次，于（26±1）℃光照/黑暗（14h/10h）周期條件下培養(yǎng)1個月，開始采集魚卵.飼養(yǎng)用水經(jīng)生物過濾器過濾并充分曝氣，pH值保持約8.0.

1.2 試驗方法

將轉(zhuǎn)基因斑馬魚種魚Tg（lfabp10a： dsRed；elaA： EGFP）與野生型斑馬魚種魚進(jìn)行雜交，得到斑馬魚魚卵.將一定濃度梯度的上述溶液加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入8mL試液，放20枚挑過的發(fā)育良好的受精卵，進(jìn)行零時（卵產(chǎn)出并受精1h內(nèi)）染毒.在人工氣候箱培養(yǎng)6d，每2d換一次溶液，第6d在熒光顯微鏡下篩選各暴露組具有熒光表達(dá)的斑馬魚幼魚.將各組篩選好的魚進(jìn)行麻醉、固定成相同的姿勢，利用熒光顯微鏡（ZEISS Axiovert 200M）觀察幼魚中熒光表達(dá)，并利用數(shù)碼相機(jī)（ZEISS AxiocCam HRC）下在相同放大倍數(shù)和曝光時間下拍照記錄熒光表達(dá)量.利用Image J軟件定量分析GFP的熒光表達(dá)量，比較各暴露組的熒光表達(dá)差異.

1.3 統(tǒng)計分析

每個實驗組設(shè)3個平行樣.采用SPSS 13.0軟件，組內(nèi)進(jìn)行student-t檢驗，并用標(biāo)準(zhǔn)誤差SD表示；組間用one way-ANOVA檢驗，P＜0.05表示有顯著差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 CdCl2單獨(dú)暴露對斑馬魚仔魚肝臟發(fā)育的影響

圖1 1H-BTR和CdCl2誘導(dǎo)下斑馬魚肝臟lfabp10a的熒光表達(dá)Fig.1 The fluoresce expressions of lfabp10a in zebrafish liver induced by 1H-BTR and CdCl2紅色顯示部分為斑馬魚肝臟lfabp10a的熒光量

如圖1所示，外源化合物對轉(zhuǎn)基因斑馬魚仔魚肝臟主要有兩個方面的影響，一是使斑馬魚仔魚肝臟處熒光量增大，表明肝型脂肪酸結(jié)合蛋白相關(guān)基因lfabp10a表達(dá)量增強(qiáng)、肝臟尺寸膨大，這與肝組織發(fā)生炎癥從而充血、水腫的現(xiàn)象相一致，可提示其發(fā)生肝臟炎癥的風(fēng)險性增強(qiáng)；另一方面斑馬魚仔魚肝臟處熒光量減弱，表明肝型脂肪酸結(jié)合蛋白相關(guān)基因lfabp10a表達(dá)量下降、肝臟尺寸減小，提示其具有抑制肝臟發(fā)育和肝臟細(xì)胞損傷毒性.

不同濃度CdCl2暴露下，如圖2所示，斑馬魚肝臟表現(xiàn)為低濃度（0.001，0.01，0.1μmol/L）lfabp10a表達(dá)量增強(qiáng)，肝臟相對空白對照顯著膨大（P＜ 0.005）；而有意思的是在高濃度CdCl2暴露下（1μmol/L）斑馬魚肝臟發(fā)育受到抑制，肝臟尺寸相對空白對照顯著降低（P＜0.005）.通常認(rèn)為高劑量的CdCl2會導(dǎo)致胚胎發(fā)育延緩及異常［17-18］，這與本研究發(fā)現(xiàn)的1μmol/L CdCl2抑制斑馬魚肝臟發(fā)育的結(jié)論相一致.低劑量CdCl2暴露使斑馬魚肝臟變得膨大，可以推導(dǎo)低劑量CdCl2會誘導(dǎo)斑馬魚肝臟發(fā)生炎癥作用.任亞萍等［19］也發(fā)現(xiàn)低劑量CdCl2會導(dǎo)致小鼠大量肝細(xì)胞水樣變性，炎癥細(xì)胞聚集明顯.

圖2 CdCl2對斑馬魚的肝臟毒性Fig.2 Hepatotoxicity of CdCl2in zebrafish liver a-與對照組比，P＜0.05

2.2 1H-BTR單獨(dú)暴露對斑馬魚仔魚肝臟發(fā)育的影響

如圖3所示，1H-BTR相對CdCl2而言毒性較低，低濃度（0.2和1μmol/L）1H-BTR暴露時，無顯著毒性效應(yīng)，只在5μmol/L暴露時表現(xiàn)為lfabp10a表達(dá)量增強(qiáng)、肝臟膨大（P=0.000），并且劑量-效應(yīng)作用顯著（R2=0.903）.

鑒于BTRs在水環(huán)境中高溶解度（高達(dá)28g/L），及其在水環(huán)境中的大量暴露（如紫外防曬劑、防凍劑等可以直接進(jìn)入環(huán)境水體，也能夠通過污水處理廠間接進(jìn)入水環(huán)境中），并且BTRs穩(wěn)定性較高、難降解、在環(huán)境中將會長期存在，BTRs的水生生物毒性引起了極大的關(guān)注.但是目前只有少量報道其對水生生物（綠藻、大型蚤、斑馬魚等）的急性毒性效應(yīng)［20］，觀察的指標(biāo)主要為半致死濃度（LC50）和半效應(yīng)濃度（EC50，如對大型蚤繁殖的半數(shù)抑制率［20］），作用的濃度范圍為mg/L級.目前為止僅有一篇文獻(xiàn)對其發(fā)育毒性進(jìn)行研究，即苯并三唑?qū)ΣＡШＧ誓c（Ciona Intestinalis）48h孵化率抑制的最低無效應(yīng)濃度（LOEC）為32mg/L［21］.BTRs在實際水生環(huán)境中都以較低劑量形式存在（μg/L），很少有其慢性毒性的相關(guān)報道.

圖3 1H-BTR對0.1μmol/L CdCl2斑馬魚肝臟毒性的影響Fig.3 The influence of 1H-BTR on the toxicity of 0.1μmol/L CdCl2in zebrafish liver

本次研究發(fā)現(xiàn)5 μmol/L（約0.5mg/L）1HBTR亞慢性暴露可顯著導(dǎo)致斑馬魚肝型脂肪酸結(jié)合蛋白相關(guān)基因lfabp10a表達(dá)增強(qiáng)、肝臟尺寸變大.劉世博也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過21d苯并三唑暴露后，藍(lán)子魚肝體比指數(shù)隨暴露濃度增加而增加［22］.因此，環(huán)境中BTRs對人體健康存在潛在威脅.

2.3 CdCl2和1H-BTR聯(lián)合暴露對斑馬魚仔魚肝臟發(fā)育的影響

根據(jù)1H-BTR和CdCl2單獨(dú)暴露對斑馬魚仔魚肝臟毒性效應(yīng)，分別以0.1和1μmol/L CdCl2為研究對象，在其基礎(chǔ)上分別加入上述濃度梯度（0.2，1，5μmol/L）的1H-BTR，研究其聯(lián)合暴露效應(yīng).

在0.1μmol/L CdCl2基礎(chǔ)上加入不同濃度梯度的1H-BTR，如圖3所示，這兩種物質(zhì)在聯(lián)合暴露濃度范圍內(nèi)都表現(xiàn)為促使斑馬魚仔魚肝臟膨大、誘導(dǎo)lfabp10a基因表達(dá)作用.但是隨著聯(lián)合暴露中1H-BTR濃度增大，促使斑馬魚肝臟膨脹的毒性反而降低，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系（R2=0.833）.在最高聯(lián)合暴露組0.1μmol/L CdCl2/5μmol/L 1H-BTR，斑馬魚仔魚的肝臟尺寸已與對照無顯著差異（P=0.159）.因此0.1μmol/L CdCl2和1H-BTR在聯(lián)合暴露中表現(xiàn)為拮抗作用.

試驗進(jìn)一步在1μmol/L CdCl2基礎(chǔ)上加入不同濃度梯度的1H-BTR.根據(jù)單獨(dú)暴露結(jié)果，1μmol/L CdCl2表現(xiàn)為抑制肝臟lfabp10a表達(dá)作用，1H-BTR在暴露濃度范圍內(nèi)都表現(xiàn)為誘導(dǎo)斑馬魚lfabp10a表達(dá)作用.如圖4所示，聯(lián)合暴露中斑馬魚肝臟都繼續(xù)表現(xiàn)為lfabp10a表達(dá)量減弱、肝臟尺寸降低現(xiàn)象，這與CdCl2單獨(dú)暴露的結(jié)果一致.但是隨著聯(lián)合暴露中1H-BTR濃度增大，斑馬魚肝臟尺寸降低的程度減小，并且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系（R2=0.884）.從這個角度來看，1μmol/L CdCl2和1H-BTR在聯(lián)合暴露中也表現(xiàn)為拮抗作用.

圖4 1H-BTR對1μmol/L CdCl2斑馬魚肝臟毒性的影響Fig.4 The influence of 1H-BTR on the toxicity of 0.1μmol/L CdCl2in zebrafish liver

水體中重金屬的毒性會受到非生物因素的制約，如溫度、pH值、游離離子濃度、有機(jī)物的絡(luò)合作用等.環(huán)境中重金屬具有強(qiáng)烈的急性毒性、及“三致”等各種慢性毒性［23］.大部分工作認(rèn)同有機(jī)絡(luò)合實際可以大大降低重金屬的毒性，因為金屬與有機(jī)試劑的絡(luò)合降低了游離形態(tài)的濃度［24］.BTRs芳香環(huán)上的氮硫雜原子上有孤對電子、易于與各種重金屬離子或受體結(jié)合發(fā)生螯合作用從而使其毒性降低.這與本試驗研究發(fā)現(xiàn)相一致，即1H-BTR能顯著降低0.1和1μmol/L CdCl2對斑馬魚仔魚肝臟毒性.陳敏等［25］也發(fā)現(xiàn)加入螯合劑N-對羥甲苯甲基-D-葡萄糖二硫代氨基甲酸鈉（HBGD）后，使得鎘對小鼠睪丸的毒性顯著下降.

動物體的不同組織對某種重金屬具有高度選擇性，腎臟和肝臟由于可以快速大量合成金屬硫蛋白使重金屬得以大量蓄積，所以稱為重金屬蓄積的重要靶器官［26］.由于對BTRs研究的嚴(yán)重不足，目前國內(nèi)外沒有BTRs在生物體內(nèi)蓄積分布和毒性靶器官研究的任何報道，很難推測BTRs和重金屬聯(lián)合毒性作用效果是否的確是由于這兩者之間的螯合作用產(chǎn)生的.而這兩類物質(zhì)在環(huán)境中廣泛分布并長期存在，因此對于其聯(lián)合毒性的研究有待加強(qiáng).

3 結(jié)論

3.1 0.1μmol/L CdCl2單獨(dú)暴露使斑馬魚肝型脂肪酸結(jié)合蛋白相關(guān)基因lfabp10a表達(dá)量顯著增強(qiáng)，增大斑馬魚肝臟炎癥的風(fēng)險；1μmol/L CdCl2抑制lfabp10a的表達(dá)，證明其肝臟發(fā)育抑制作用.

3.2 1H-BTR相對CdCl2毒性較低，5μmol/L暴露時導(dǎo)致斑馬魚肝型脂肪酸結(jié)合蛋白相關(guān)基因lfabp10a表達(dá)量增強(qiáng).

3.3 1H-BTR和CdCl2對斑馬魚的肝臟毒性具桔抗作用.

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Joint toxicity of benzotriazole and cadmium to zebrafish liver.

DUAN Zheng-hua1*，CHEN Xiao-ou1，LIU Ling-li1，GONG Zhi-yuan2，LI Cai-xia2（1.School of Environmental Science and Safety Engineering，Tianjin University of Technology，Tianjin，300384，China；2.Department of Biological Sciences，National University of Singapore，117543 Singapore）.China Environmental Science，2015，35（6）：1872～1876

Transgenic zebrafish Tg（lfabp10a： dsRed；elaA：EGFP）was used to explore the single and joint hepatotoxicities of benzotriazole and its derivatives（BTRs）and cadmium in the environment.The results showed that，the expression of liver-type fatty acid binding protein related gene lfabp10a in zebrafish was up-regulated under the exposure of 0.001 to 0.1μmol/L CdCl2，and the size of the liver was significant enlarged than that in the control group（P＜0.005）.But the expression of lfabp10a in zabrafish liver was inhibited by 1 μmol/L CdCl2，and the liver size was apparently decreased（P＜0.005）.Toxicity of 1H-BTR（1H-benzotriazole）was much lower when compared with that of CdCl2，and lfabp10a expressed in zebrafish liver was up-regulated under exposure of 5μmol/L 1H-BTR.The hepatotoxicity of CdCl2was significantly reduced by 1H-BTR（P=0.000）in their combined exposure.Therefore，benzotriazole plays an important role in the evaluation of the toxicities of environmental pollutants.

benzotriazole；cadmium；transgenic zebrafish；joint toxicity

X171.5

A

1000-6923（2015）06-1872-05

端正花（1981-），女，江蘇鎮(zhèn)江人，講師，博士，主要從事環(huán)境生物標(biāo)志物的篩選方向的研究.發(fā)表論文10余篇.

2014-11-10

天津市2013年優(yōu)秀博士后國際化培養(yǎng)計劃；天津市教委重點(diǎn)調(diào)研課題（JWDY-20142015）

* 責(zé)任作者，講師，duanzhenghua@mail.nankai.edu.cn