鈕俊興，胡立宏

（中國科學(xué)院上海藥物研究所，中藥現(xiàn)代化中心，上海　201203）

芬戈莫德研發(fā)歷程概述

鈕俊興，胡立宏

（中國科學(xué)院上海藥物研究所，中藥現(xiàn)代化中心，上海201203）

芬戈莫德是以真菌的次級代謝產(chǎn)物ISPI為苗頭化合物所研發(fā)的免疫調(diào)節(jié)劑，于2010年被FDA批準(zhǔn)上市，用以治療免疫性疾病多發(fā)性硬化癥。與傳統(tǒng)的免疫抑制劑不同，它不影響淋巴細(xì)胞的活化和增殖，主要作用于細(xì)胞表面的1-磷酸鞘氨醇（S1P）受體來發(fā)揮免疫抑制和免疫調(diào)控作用。本文通過梳理芬戈莫德的研發(fā)流程，闡述結(jié)構(gòu)優(yōu)化和改造步驟，為藥物化學(xué)研究提供經(jīng)驗。

芬戈莫德；ISP-I；多發(fā)性硬化癥免疫調(diào)節(jié)劑

專家簡介

胡立宏，男，中國科學(xué)院上海藥物研究所研究員、研究組長、博士生導(dǎo)師，研究工作主要涉及“基于中草藥資源的藥物發(fā)現(xiàn)”研究領(lǐng)域?，F(xiàn)任世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會中藥分析專業(yè)委員會理事、中國植物學(xué)會民族植物學(xué)分會理事、上海市藥學(xué)會天然藥化專業(yè)委員會委員、上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室學(xué)術(shù)委員會委員，以通訊作者身份在Journal of Neuroscience，Chemistry&Biology，Journal of Medicinal Chemistry，Diabetes，Green Chemistry，Organic Letters等國際主流刊物上發(fā)表研究論文190余篇，獲得發(fā)明專利授權(quán)10余項。2009年以“天然藥物化學(xué)”研究方向獲得“國家杰出青年基金”資助，并入選“中國科學(xué)院百人計劃”，2012年獲得了“上海市優(yōu)秀學(xué)科帶頭人”稱號。

1　背景

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c的自身免疫病。目前全球約有250萬人受MS困擾，多發(fā)于20～40歲青年人群，女性患者為男性兩倍［1］。發(fā)病原因未知，一般認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、自身免疫等因素有關(guān)。MS最常累及的部位為腦室，會造成不可逆的神經(jīng)損傷，并因此產(chǎn)生廣泛的癥狀，諸如肢體無力、精神異常、共濟(jì)失調(diào)、視力衰退等［2］。

目前，臨床上用于治療MS的藥物有免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑和抗炎藥3類［3］，但這些藥物對于MS的治療療效不顯著且副作用大。因此，人們迫切需要一種療效好，病人依從性好，副作用小的藥物。而芬戈莫德（Fingolimod）的出現(xiàn)，為廣大患者帶來了福音。

芬戈莫德是來源于天然產(chǎn)物的、首個口服給藥的用于治療MS的新型免疫抑制劑。它通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的1-磷酸鞘氨醇（S1P）受體，使淋巴細(xì)胞回流至淋巴結(jié)從而起到降低MS復(fù)發(fā)頻率、延緩病程的作用［4，5］。

2　芬戈莫德的研發(fā)歷程

2.1苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)中葉后，隨著青霉素類抗生素的興起，從細(xì)菌、真菌的代謝產(chǎn)物中尋找活性物質(zhì)成為潮流，日本科學(xué)家藤田也不例外，他的研究對象是真菌辛克萊蟲草（Cordyceps sinclairii）和其近親冬蟲夏草（Cordyceps sinensis），并在20世紀(jì)80年代末分離得到化合物ISP-I［6，7］。

ISP-I有較強(qiáng)的免疫抑制活性，與已有抗MS藥物環(huán)孢素A（CsA）相比，體外活性是后者的5～10倍，體內(nèi)活性是其10～100倍［8］。但是，該化合物的毒性比CsA大100倍，且溶解度低，成藥性差；同時手性原子較多，結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，想要成為藥物用于臨床還需進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

因此，藤田小組決定以ISP-I作為苗頭化合物（Hit），從結(jié)構(gòu)簡化角度入手，通過進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化獲得成藥性更佳的候選化合物。

為了定量的衡量和評價所得化合物的免疫抑制活性，藤田小組設(shè)計了兩種生物學(xué)模型來評價化合物的免疫抑制作用：分別是體外的T細(xì)胞活性抑制實驗和體內(nèi)的小鼠間皮移植實驗［9］。體外試驗通過測定T細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）來表征化合物免疫抑制活性；體內(nèi)實驗通過測定小鼠皮移植后平均存活時間（MST），間接評價化合物抑制活性和毒性。

2.2先導(dǎo)化合物的確定藤田小組在得到真菌次生代謝產(chǎn)物—化合物1（ISP-I）的同時，同時還得到其同系物2（Mycestericin D）、3（Mycestericin E）、4（Mycestericin F）和5（Mycestericin G）［10］，其結(jié)構(gòu)如表1所示。

分析表1的數(shù)據(jù)，可以得出初步的結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系：化合物2與1比較，其少了4-OH，活性略微下降，說明4-OH為活性非必需基團(tuán)，可以除去；化合物2與3活性相差不大，說明3-OH的構(gòu)型與活性無關(guān)；6、7位雙鍵還原后的化合物4和5活性顯著下降，說明6，7位雙鍵是活性必須的。

2.2.114位羰基的必要性為研究14位羰基的必要性，藤田小組設(shè)計、合成了化合物6、7，如表1所示。

比較化合物1、6、7的活性數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，將羰基還原為羥基活性略有下降；將羰基轉(zhuǎn)變?yōu)閬喖谆钚月杂刑嵘f明羰基并非活性必須基團(tuán)，將其還原為亞甲基可簡化結(jié)構(gòu)，并提高活性。

表1　化合物1～7對T細(xì)胞抑制活性數(shù)據(jù)表

2.2.22位手性碳構(gòu)型與活性關(guān)系再次分析原型化合物1的結(jié)構(gòu)，其2位是一個手性碳，合成難度較大，不利于進(jìn)一步修飾改造；同時1又包含酸、堿兩性結(jié)構(gòu)和親水、親脂的兩性結(jié)構(gòu)，水溶性低。于是藤田小組又嘗試探索2位手性碳構(gòu)型和羧基對于活性的影響，設(shè)計并合成了一系列化合物8～11［11］，見表2。

表2　化合物8～11對T細(xì)胞抑制活性數(shù)據(jù)表

比較化合物1和8發(fā)現(xiàn)，2位手性碳構(gòu)型與活性無關(guān)，1-COOH可還原為1-CH2OH；化合物10、11的活性喪失進(jìn)一步驗證了對脂肪鏈進(jìn)行構(gòu)象限制對生物活性是至關(guān)重要的。

2.2.3脂肪鏈鏈長與活性關(guān)系接下來，藤田小組考察脂肪鏈長度與活性的關(guān)系，為此，他們設(shè)計了一系列化合物12a～12j［12］，如表3所示。

分析表3的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)脂肪鏈碳原子數(shù)目為15（12f）或14（12e）時，化合物活性均較好；而碳原子數(shù)目大于15或小于14時，化合物的活性均顯著降低；進(jìn)而以口服給藥方式繼續(xù)比較12e和12f的體內(nèi)活性（見表7），結(jié)果顯示，當(dāng)給藥劑量為30 mg·kg-1時，CsA的MST為20.5d，12e為52.2d，而12f則表現(xiàn)出毒性?；衔?2e口服給藥下的生存期明顯長于化合物12f和陽性對照藥CsA，因此，可以確定脂肪鏈長度為14的碳原子時，其活性較好，毒性較小。

表3　化合物12a～12j對T細(xì)胞抑制活性數(shù)據(jù)表

根據(jù)以上結(jié)果，藤田小組決定以12e為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化?；衔?2e的結(jié)構(gòu)由右側(cè)親脂部分和左側(cè)親水部分組成，因此接下來將分別對這2個部分進(jìn)行修飾改造。

2.3親脂部分改造

2.3.1引入芳香環(huán)由上文已知脂肪鏈上6、7位雙鍵對于化合物活性是必不可少的，分析原因可能是脂肪鏈柔性過大，而雙鍵可起到限制構(gòu)象以及π-π堆積的作用。于是藤田小組嘗試引入苯環(huán)，在保持脂肪鏈碳原子總數(shù)為14的同時，獲得了苯環(huán)處于不同位置的系列化合物14～21，見表4。

表4　化合物13～21對T細(xì)胞抑制活性數(shù)據(jù)表

分析表4的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物16活性較好，證明猜想正確：即引入苯環(huán)可以限制構(gòu)象，提高化合物生物活性；同時也得知芳香環(huán)與親水部分之間間隔2個碳原子的距離為佳。

2.3.2苯環(huán)右側(cè)脂肪鏈鏈長與活性關(guān)系由上文已知，引入苯環(huán)可提高活性，且環(huán)與親水部分需間隔2個碳原子。隨后，藤田小組又合成了一系列化合物22～28，用以確定苯環(huán)右側(cè)脂肪鏈長度與活性的關(guān)系，如表5所示。

表5　化合物22～28對T細(xì)胞抑制活性表

分析表5的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在保證苯環(huán)與親水部分間隔兩個碳原子的前提下，化合物活性對苯環(huán)上的脂肪鏈取代基長度不明感，因為化合物22～28大多具有良好的生物活性。其中活性最好的化合物23因體內(nèi)活性弱于化合物16（見表7），故藤田小組決定保持苯環(huán)上連接正辛基，即以化合物16繼續(xù)進(jìn)行改造。

2.3.3苯環(huán)與脂肪鏈連接部分改造接著，藤田小組又合成了化合物29～34，嘗試對苯環(huán)和脂肪鏈的連接部分進(jìn)行改造，化合物結(jié)構(gòu)與活性如表6所示。

表6　化合物29～34對T細(xì)胞抑制活性表

分析表6的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)化合物29有與16相當(dāng)?shù)幕钚?，但其在體內(nèi)中，3 mg·kg-1情況下顯示出毒性（見表7）；引入氧原子的32也具有與16相當(dāng)?shù)幕钚?，但MST比16短；引入硫原子所得的33活性也很好，遺憾的是毒性也隨之增大；引入含氮基團(tuán)所得的31與34活性較差。

以上結(jié)論說明芐位的改造不利于化合物活性的提高和毒性的降低。

2.3.4苯環(huán)上脂肪鏈取代基位置確定隨后藤田小組合成了化合物35、36，用來確定苯環(huán)上脂肪鏈取代基位置對于化合物活性的影響，如表8所示。

表7　相關(guān)化合物小鼠皮移植存活時間表

分析表8的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)脂肪鏈取代基位于苯環(huán)對位時活性最高，而位于鄰位、間位時活性喪失。

表8　取代基位置與T細(xì)胞抑制活表

綜合以上結(jié)果，化合物12e親脂部分的結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到藥物候選物16。

2.4親水部分改造接下來藤田小組對先導(dǎo)化合物12e的親水部分也進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化?？紤]到“2.3.3”中芐位引入氧原子有可能提高化合物生物活性，于是，設(shè)計了相關(guān)化合物37～47，分別考察芐位原子和親水部分的取代基對于化合物活性的影響，結(jié)構(gòu)與活性如表9所示。

分析表9的數(shù)據(jù)可知，參照ISP-I結(jié)構(gòu)將羥甲基氧化為羧基、或直接去除都會使化合物活性大大下降（化合物37、38）；將羥甲基鏈長伸長也會使活性小幅度下降（化合物45～47），說明羥甲基不是一個合適的改造位點；而在芐位引入氧原子的情況下，化合物39～45的體外活性相對于16均有一定程度的下降，說明芐位引入雜原子不利于生物活性的保持。

表9　化合物37～47對T細(xì)胞的抑制活性

綜合以上結(jié)果，藤田等選擇化合物16（FTY720）作為候選化合物進(jìn)行臨床研究，在順利通過Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期臨床后，于2010年被FDA批準(zhǔn)上市，用于治療MS，這也是首個口服給藥的用于治療MS的新型免疫抑制劑。

3　芬戈莫德治療MS機(jī)制研究

Brinkmann等［1］對芬戈莫德的抗MS機(jī)制進(jìn)行了細(xì)致的研究，得到了有趣的結(jié)果。

鞘氨醇（sphingosine）被鞘氨醇激酶2磷酸化形成S1P（見圖1）是產(chǎn)生T細(xì)胞與B細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)的起始步驟。而S1P是5個不同的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的激活劑，這些G蛋白偶聯(lián)受體的激活是淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞在體內(nèi)釋放的必要過程［13，14］。

圖1　鞘氨醇和S1P結(jié)構(gòu)圖

淋巴細(xì)胞的過度釋放，會導(dǎo)致諸如MS、內(nèi)部炎癥、細(xì)胞凋亡等多種病理過程。目前MS的治療藥物有CsA和他克莫司（FK506），其機(jī)理是通過抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶從而抑制鞘氨醇的生物合成，使相關(guān)的S1P受體1～5不能激活，最終抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的釋放，使身體不能產(chǎn)生任何免疫反應(yīng)，起到緩解MS的作用。

而抗MS新藥芬戈莫德（Fingolimod）具有獨特和新穎的作用機(jī)制：芬戈莫德一旦吸收入血，將迅速被鞘氨醇激酶2磷酸化成磷酸化芬戈莫德（見圖2），后者與內(nèi)源性配體S1P具有結(jié)構(gòu)相似性，因而能夠競爭性的結(jié)合到 S1P受體上，起到阻斷 GPCRs信號傳導(dǎo)的作用［4，15］。母體芬戈莫德沒有任何受體結(jié)合能力，體內(nèi)藥代動力學(xué)研究也已證實，口服芬戈莫德后，磷酸化芬戈莫德的血藥濃度是其母體的4倍［16，17］，這也是其得以發(fā)揮藥理活性的基礎(chǔ)。

圖2　芬戈莫德和磷酸化芬戈莫德結(jié)構(gòu)圖

4　總結(jié)

藤田在發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物ISP-I的免疫抑制活性后，通過分析確定了以化合物12e作為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行了進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾與改造，獲得活性化合物16（FYP720，芬戈莫德），并最終于2010年被FDA批準(zhǔn)上市［18］，它的優(yōu)化過程對我們啟示頗多。

4.1簡化結(jié)構(gòu)、去除手性原子。最初發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物ISP-I具有3個手性中心，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，合成困難，不利于進(jìn)一步研究。藤田組首先就探索了手性碳原子的必要性，在確定了其不影響活性后，改用去手性衍生物進(jìn)行后續(xù)探索。利用藥物改造的基本思想，在進(jìn)一步簡化了結(jié)構(gòu)的同時，提高了化合物活性，降低了合成難度和成本，使得后續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。

4.2增加溶解度，降低毒性。前體化合物ISP-I的水溶解性很低且毒性大，因此藤田小組在保證活性的基礎(chǔ)上，通過生物電子等排、保持藥效團(tuán)等手段改善了化合物的水溶性，同時使毒性降低到可接受范圍內(nèi)，推動了其走向臨床的過程。

4.3合理的篩選模型。芬戈莫德是在受體未知的情況下，基于藥物化學(xué)理論改造出的藥物，而后續(xù)的藥理研究表明，它其實是個前藥，在體內(nèi)通過形成磷酸化活性物質(zhì)發(fā)揮作用。如果藤田采用分子水平模型而非細(xì)胞水平模型，那么將會與此化合物失之交臂。正是這種曲折歷程，才讓藥物化學(xué)這門學(xué)科總是神秘與驚喜并存，令無數(shù)藥化工作者流連忘返。

［1］Brinkmann V.FTY720（fingolimod）in Multiple Sclerosis：therapeutic effects in the immune and the central nervous system［J］.Br J Pharmacol，2009，158（5）：1173-1182.

［2］Miron VE，Schubart A，Antel JP.Central nervous system-directed effects of FTY720（fingolimod）［J］.J Neurol Sci，2008，274（1-2）：13-17.

［3］Ebers GC.A full genome search in multiple sclerosis［J］. Nat Genet，1996，13（4）：472-476.

［4］Deogracias R，Yazdani M，Dekkers MP，et al.Fingolimod，a sphingosine-1 phosphate receptor modulator，increases BDNF levels and improves symptoms of a mouse model of Rett syndrome［J］.Proc Nati Acad Scis，2012，109（35）：14230-14235.

［5］Chiba K，Adachi K.Discovery of fingolimod，the sphingosine 1-phosphate receptor modulator and its application for the therapy of multiple sclerosis［J］.Future Med Chem，2012，4（6）：771-781.

［6］Fujita T，Matsumoto N，Uchida S，et al.Antibody against a novel，myriocin（ISP-I）-based immunosuppressant，F(xiàn)TY720［J］.Bioorg Med Chem Lett，2000，10（4）：337-339.

［7］St-Jacques M.Elucidation of structure and stereochemistry of myriocin.A novel antifungal antibiotic［J］.J Org Chem，1973，38（7）：1253-1260.

［8］Fujita T，Yoneta M，Hirose R，et al.Simple compounds，2-alkyl-2-amino-1，3-propanediols have potent immunosuppressive activity［J］.Bioorg Med Chem Lett，1995，5（8）：847-852.

［9］Suzuki S，Li XK，Enosawa S，et al.A new immunosuppressant，F(xiàn)TY720，induces bcl-2-associated apoptotic cell death in human lymphocytes［J］.Immunology，1996，89（4）：518-523.

［10］Hamamichi N，F(xiàn)ujita T，Matsuzaki T，et al.14 determination of the absolute configurations and total synthesis of new immunosuppressants，mycestericins D，E，F(xiàn) and G ［J］.Natural Organic Compounds Debate Abstracts（Japan），1995，37：79-84.

［11］Fujita T，Hirose R，Yoneta M，et al.Potent immunosuppressants，2-alkyl-2-aminopropane-1，3-diols［J］. J Med Chem，1996，39（22）：4451-4459.

［12］Kiuchi M，Adachi K，Kohara T，et al.Synthesis and immunosuppressive activity of 2-substituted 2-aminopropane-1，3-diols and 2-aminoethanols［J］.J Med Chem，2000，43（15）：2946-2961.

［13］Sanchez T，Hla T.Structural and functional characteristics of S1P receptors［J］.J Cell Biochem，2004，92（5）：913-922.

［14］Sanchez T，Estrada-Hemandez T，Paik JH，et al.Phosphorylation and action of the immunomodulator FTY720 inhibits vascular endothelial cell growth factor-induced vascular permeability［J］.J Biol Chem，2003，278（47）：47281-47290.

［15］Pitman MR，Woodcock JM，Lopez AF，et al.Molecular targets of FTY720（fingolimod）［J］.Curr Mol Med，2012， 12（10）：1207-1219.

［16］Pchejetski D，Bohler T，Brizuela L，et al.FTY720（fingolimod）sensitizes prostate cancer cells to radiotherapy by inhibition of sphingosine kinase-1［J］.Cancer Res，2010，70（21）：8651-8661.

［17］Paugh SW，Payne SG，Barbour SE，et al.The immunosuppressant FTY720 is phosphorylated by sphingosine kinase type 2［J］.FEBS Lett，2003，554（1-2）：189-193.

［18］郭宗儒.從天然產(chǎn)物到免疫調(diào)節(jié)藥物芬戈莫德［J］.藥學(xué)學(xué)報，2014，49（1）：148-150.

A research and development overview of Fingolimod

NIU Jun-xing，HU Li-hong
（Shanghai Research Center for Modernization of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China）

Fingolimod（FTY720），a novel immunomodulator agent，is developed from ISP-I，which is a secondary metabolites of fungi.It was approved by FDA in 2012 for the treatment of autoimmune disease multiple sclerosis.Unlike the traditional immunosuppressive agents，fingolimod exerts immunosuppressive and immunoregulatory functions mainly through interaction with shhingosine-1-phosphate（S1P）receptors on the cell surface without affecting activation and proliferation of lymphocyhtes.This article briefly reviewed the development process of fingolimod，elaborate the structural optimization and transformation，in order to provide experience for chemical rsearch.

Finglimod；ISP-I；Multiple Sclerosis；Immunomodulator

R979.1

A

2095-5375（2015）12-0683-006

國家自然科學(xué)基金面上項目（No.81473110）