呂佳寧， 李 影， 韓立杰， 劉子菱， 張 玲， 金鐵巖，2，*

（1.延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉 133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002）

蜂花粉3種溶劑提取物的抗氧化性研究

呂佳寧1， 李 影1， 韓立杰1， 劉子菱1， 張 玲1， 金鐵巖1，2，*

（1.延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉 133002；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002）

為了綜合評(píng)價(jià)蜂花粉不同溶劑提取物的抗氧化效果，以水、甲醇和三氯甲烷為提取溶劑，對(duì)蜂花粉進(jìn)行多次綜合提取，計(jì)算其得率后，對(duì)DPPH清除率、·O-陰離子清除率、·OH-自由基清除率和還原力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：3種溶劑提取物中，蜂花粉水提物的得率最高，為54.16%。蜂花粉甲醇提取物的DPPH清除率、·O-清除率和·OH-自由基清除率均優(yōu)于其他兩種溶劑且存在濃度依賴關(guān)系，當(dāng)甲醇提取物的質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，其DPPH清除率達(dá)到95.49%，且當(dāng)甲醇提取物的質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，·O-陰離子和·OH-自由基清除率分別為80.03%，29.14%。蜂花粉三氯甲烷提取物還原力最強(qiáng)，并且還原力與濃度存在依賴關(guān)系，三氯甲烷提取物質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，還原力達(dá)到49.48%。實(shí)驗(yàn)表明，蜂花粉的甲醇提取物抗氧化能力較強(qiáng)。

蜂花粉；溶劑提取物；抗氧化能力

花粉是植物的精細(xì)胞，在雄蕊的花藥中產(chǎn)生。蜂花粉是蜜蜂從開花的蜜源植物內(nèi)采集的花粉，加上蜜蜂自身的腺體分泌的物質(zhì)以及唾液混合后，形成的不規(guī)則扁圓形團(tuán)狀物［1］。花粉的花粉壁由內(nèi)壁和外壁組成，外壁比較堅(jiān)硬，主要成分為孢粉素，抗水、抗腐蝕性很強(qiáng)，并且不易發(fā)生滲透作用，基本上與大部分物質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)；內(nèi)壁主要成分為纖維素和果膠等物質(zhì)，質(zhì)地比較薄軟，不耐酸堿。由于蜂花粉結(jié)構(gòu)比較特殊，如果不對(duì)其進(jìn)行破壁提取的話，里面的物質(zhì)只能通過內(nèi)壁的萌發(fā)孔和萌發(fā)溝［2］緩慢釋放出來，不易于內(nèi)容物的提取，造成花粉內(nèi)功能性成分以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)。

蜂花粉幾乎含有人體所需的所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)成分豐富且完全。相關(guān)研究顯示，它的蛋白質(zhì)含量是牛肉和雞蛋的5～7倍，含有8種人體必需氨基酸，且游離氨基酸比例適當(dāng)［3］，易于人體消化吸收。蜂花粉還含有不飽和脂肪酸、酶類、核酸、多酚、黃酮、多糖等生理活性成分。蜂花粉對(duì)癌癥、心臟病、高血壓、高血脂、高血糖等多種疾病有很好的預(yù)防和改善作用，并且對(duì)增強(qiáng)抵抗力、記憶力，改善腦功能也有很好的作用［4］。

蜂花粉為全營(yíng)養(yǎng)食品，其成分較為復(fù)雜，且需破壁后才能進(jìn)行內(nèi)容物提取。在以往的蜂花粉抗氧化測(cè)定中，多數(shù)用70%左右乙醇溶液對(duì)破壁后的蜂花粉進(jìn)行提取，很少有研究用純有機(jī)溶劑直接提取蜂花粉。本實(shí)驗(yàn)用水、甲醇、三氯甲烷分別對(duì)蜂花粉進(jìn)行充分提取，揮干溶劑得到提取物，然后測(cè)定提取物的抗氧化能力，并以Vc為陽(yáng)性對(duì)照，確定哪一種溶劑更為適合提取蜂花粉。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂花粉，長(zhǎng)白山脈野生蜂花粉；乙醇、三氯甲烷、維生素C、DPPH、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純。

1.2 主要儀器

SB-10A型高速粉碎機(jī)，上海市蒲恒信息科技有限公司；U-3900型紫外分光度計(jì)，Hitachi High-Technologies Corporation Tokyo Japan；THA-B型氣浴恒溫振蕩器，金壇市恒豐儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

選擇長(zhǎng)白山山脈的野生蜂花粉，收集后將其高速粉碎，將粉碎后的蜂花粉粉末過60目篩，之后將剩余粉末繼續(xù)粉碎，重復(fù)上一步操作，直至所有粉末全部通過60目篩網(wǎng)，于低溫下保存。

1.3.2 蜂花粉的破壁

采用復(fù)合破壁法對(duì)蜂花粉粉末進(jìn)行破壁。首先將蜂花粉粉末的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至30%～35%，控制溫度為35℃，持續(xù)48 h，然后在45℃下進(jìn)行鼓風(fēng)干燥，將干燥后結(jié)成團(tuán)塊的蜂花粉再次進(jìn)行高速粉碎，這樣做的目的是將堅(jiān)硬的蜂花粉外壁變得容易被溶劑浸透，易于內(nèi)容物的釋放，然后將二次粉碎好的蜂花粉冷藏保存。

1.3.3 蜂花粉的提取及得率的測(cè)定

取5 g破壁后的蜂花粉于離心管中，按1∶8的比例添加提取溶劑，37℃下?lián)u床提取1 h，350 W超聲提取30 min，5 000 r/min離心10 min［5］，重復(fù)3次（超聲時(shí)間依次減半），將3次提取液過濾后合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，將濃縮液置于恒溫真空干燥箱內(nèi)［6］，45℃下?lián)]干其中溶劑，直至恒重后得浸膏狀固體。所得固體質(zhì)量與原蜂花粉質(zhì)量比，即為得率。

1.3.4 維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液及提取物待測(cè)液的配制

分析天平準(zhǔn)確稱取1.0 mg抗壞血酸粉末，用無水乙醇溶解后，定容至50 mL容量瓶，得0.02 g/L維生素C溶液，4℃避光保存。分析天平準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的提取物定容至25 mL容量瓶中，得適當(dāng)濃度的提取物溶液。水提取物以水為溶劑，甲醇提取物以甲醇為溶劑，三氯甲烷提取物以無水乙醇為溶劑，因?yàn)槿燃淄椴环€(wěn)定，在室溫下極易揮發(fā)、分解，如以三氯甲烷為溶劑，后續(xù)實(shí)驗(yàn)誤差極大，無法進(jìn)行。

1.3.5 DPPH清除能力的測(cè)定

根據(jù)參考文獻(xiàn)［7-8］等的方法，分別測(cè)定蜂花粉3種溶劑提取物的DPPH清除率。

1.3.6 ·O-清除能力的測(cè)定

根據(jù)蘇曉雨等［9］的方法，采用鄰苯三酚法測(cè)定蜂花粉3種溶劑提取物的·O-清除率。

1.3.7 ·OH-清除能力的測(cè)定

根據(jù)陳晨等［10］的方法，采用水楊酸法對(duì)樣品的·OH-清除能力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 還原力的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］等的方法稍作修改，測(cè)定樣品的還原力。不加樣液組吸光度為A空白，加樣液組吸光度值為A樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂花粉3種溶劑提取物得率

綜合多次提取結(jié)果，得出：蜂花粉水提取物的得率為54.16%，甲醇提取物的得率為46.06%，三氯甲烷提取物的得率為4.85%，由此可見，單從提取角度考慮，水為蜂花粉提取的較佳溶劑。

2.2 蜂花粉3種溶劑提取物DPPH清除能力

目前，對(duì)抗氧化能力的評(píng)價(jià)方法有很多，但DPPH法是一種便捷度強(qiáng)，靈敏度高且價(jià)格相對(duì)便宜的測(cè)定方法。DPPH是有機(jī)自由基，且很穩(wěn)定，通過加入抗氧化物質(zhì)，將其由紫色還原成黃色，用吸光度的變化來衡量樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱。圖1為水、甲醇、三氯甲烷3種溶劑在相同提取條件及相同濃度下測(cè)定的提取物的DPPH清除能力。3種溶劑的DPPH清除能力均隨著溶劑的質(zhì)量濃度的增大而增大，但甲醇和水提取物在質(zhì)量濃度高于4 mg/mL時(shí)，清除率增加有減緩的趨勢(shì)；甲醇提取物的DPPH清除能力明顯高于水和三氯甲烷提取物，而水和三氯甲烷提取物之間的DPPH清除能力相近。以Vc做陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)Vc質(zhì)量濃度為0.03 g/L時(shí)，DPPH清除率達(dá)到94.13%；甲醇提取物質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，DPPH清除率為95.49%，所以在此濃度下兩者的DPPH清除能力相近，但甲醇蜂花粉提取物的DPPH清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Vc。

2.3 蜂花粉3種溶劑提取物·O-清除能力

圖2為3種樣品·O-清除能力分析結(jié)果，由圖2可知，3種樣品均有·O-清除能力，且清除能力均隨著質(zhì)量濃度的增大而增加。當(dāng)甲醇提取物的質(zhì)量濃度為0.4～0.8 g/L時(shí)，其·O-清除能力與其他兩種溶劑差異不顯著；當(dāng)甲醇提取物的質(zhì)量濃度大于0.8 g/L時(shí)，其·O-清除能力增加趨勢(shì)明顯高于水提取物和三氯甲烷提取物，且三氯甲烷提取物與水提取物在各質(zhì)量濃度間的·O-清除能力均不存在顯著性差異。以Vc為陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)Vc添加量為0.02 g/L時(shí)，·O-清除率為94.53%，甲醇提取樣添加量為2 g/L時(shí)，·O-清率為80.03%，所以Vc的·O-清除能力遠(yuǎn)高于此3種溶劑的提取物。

圖1 3種溶劑提取物的DPPH清除率Fig.1 Comparison of DPPH radical scavenging activity of three solvent extracts

圖2 3種溶劑提取物的·O-清除率Fig.2 Comparison of·O-radical scavenging activity of three solvent extracts

2.4 蜂花粉3種溶劑提取物·OH-清除能力

·OH-自由基是一種很活潑的自由基，當(dāng)其與·O-發(fā)生反應(yīng)后可以破壞人體的DNA，對(duì)人體造成不可逆的傷害?！H-較容易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移、奪取氫原子，發(fā)生羥基化反應(yīng)，使體內(nèi)的糖類、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，遭到破壞［13］。圖3為蜂花粉3種溶劑提取物·OH-清除能力分析結(jié)果。由圖3可知，3種溶劑的提取物均具有·OH-清除能力，且3種溶劑提取物的清除能力差異顯著；甲醇提取物的·OH-清除能力在提取物質(zhì)量濃度為2 g/L內(nèi)基本上呈線性增長(zhǎng)；水提取物的質(zhì)量濃度為0.8～1.2 g/L時(shí)增長(zhǎng)不明顯，但當(dāng)其質(zhì)量濃度大于1.2 g/L時(shí)，增長(zhǎng)較快；三氯甲烷提取物在質(zhì)量濃度為1.6 g/L時(shí)，·OH-清除能力達(dá)到峰值，隨后下降。以Vc為陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)Vc添加量為0.02 g/L時(shí)，其清除率為38.23%。Vc的添加濃度遠(yuǎn)小于此3種溶劑提取物的添加量，所以Vc的·OH-自由基清除能力遠(yuǎn)高于此3種溶劑提取物。

圖3 3種溶劑提取物的·OH-清除率Fig.3 Comparison of·OH-radical scavenging activity of three solvent extracts

2.5 蜂花粉3種溶劑提取物還原力

還原力是指某種物質(zhì)能提供電子，與活潑自由基反應(yīng)后能轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，不再讓自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)繼續(xù)進(jìn)行下去，從而阻止自由基對(duì)人體的傷害。圖4為3種樣品在同樣提取條件及同樣濃度下測(cè)定的還原能力，由圖4可知，3種樣品均具有還原能力，且還原能力均隨著樣品濃度的增大而增加；三氯甲烷樣品的還原力增加趨勢(shì)明顯高于水和甲醇樣品。以Vc為陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)Vc的質(zhì)量濃度為0.02 g/L時(shí)，還原力為63.40%；三氯甲烷質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，還原力為49.48%，由此可見，Vc的還原力明顯高于3種溶劑的提取物。

圖4 3種溶劑提取物的還原力Fig.4 Comparison of reducing power capacity of three solvent extracts

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分別研究了蜂花粉的水提取物、甲醇提取物和三氯甲烷提取物的得率和抗氧化性，結(jié)果表明，水、甲醇、三氯甲烷3種溶劑的提取率中，水提取物的得率最高，達(dá)到54.16%；1～5 g/L甲醇提取物的DPPH清除能力均高于其他兩種溶劑提取物，當(dāng)甲醇提取物的質(zhì)量濃度達(dá)到5 g/L時(shí)，其DPPH清除率達(dá)到95.49%；0.4～2 g/L甲醇提取物的·O-清除能力高于其他兩種溶劑提取物，在甲醇提取物的質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，其清除率達(dá)到80.03%；與三氯甲烷·OH-清除率先上升后下降的趨勢(shì)相比，甲醇提取物·OH-清除率基本呈線性增長(zhǎng)，當(dāng)甲醇提取物的質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，清除率達(dá)到29.14%；1～5 g/L三氯甲烷提取物的還原能力均高于水和甲醇提取物，當(dāng)三氯甲烷提取物的濃度為5 g/L時(shí)，其還原力為49.48%，所以三氯甲烷提取物的還原力強(qiáng)于其他兩種溶劑提取物，因此蜂花粉甲醇提取物的抗氧化能力在此3種溶劑中最強(qiáng)。

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Study on Antioxidant Activities of bee Pollen Extractives Using Three Kinds Solvents

Lü Jianing1， LI Ying1， HAN Lijie1， LIU Ziling1， ZHANG Ling1， JIN Tieyan1，2，*
（1.College of Science，Yanbian University，Yanji 133002，China；2.College of Agriculture，Yanbian University，Yanji 133002，China）

To investigate the antioxidant activities of the bee pollen extractives，water，methanol，and chloroform were used as extraction solvents and DPPH eliminating rate，·O-removing rate，·OH-eliminating rate，and reducing power were determined.The results showed that the water extraction had the highest yield（54.16%）while the extractives from methanol had the highest DPPH eliminating rate，·O-removing rate，and·OH-eliminating rate and the antioxidant activities increased with the increasing concentration.The highest DPPH eliminating rate（95.49%）was obtained under the concentration of 5 g/L while the highest·O-removing rate（80.03%）and·OH-eliminating rate（29.14%）were obtained under the concentration of 2 g/L.The chloroform extracts had the highest reducing power（49.48%）under the concentration of 5 g/L.Based on the results，methanol extractives had the best antioxidant activities.

bee pollen；solvent extraction；antioxidant activities

葉紅波）

TS201.2

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.02.010

2095-6002（2015）02-0054-04

呂佳寧，李影，韓立杰，等.蜂花粉3種溶劑提取物的抗氧化性研究［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（2）：54-57.

LV Jianing，LI Ying，HAN Lijie，et al.Study on antioxidant activities of bee pollen extractives using three kinds solvents［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（2）：54-57.

2014-03-12

呂佳寧，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苄允称罚?/p>

*金鐵巖，男，副教授，博士，主要從事功能性食品方面的研究。

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