郭亞南 王麗麗 文海泉 任勇 李頌

卡介菌多糖核酸對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎的保護(hù)作用

郭亞南 王麗麗 文海泉 任勇 李頌

目的 探討卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎皮損的預(yù)防作用及可能機(jī)制。方法 外用二硝基氯苯（DNCB）反復(fù)刺激新生Nc/Nga小鼠，通過皮炎評(píng)分、搔抓行為、組織病理學(xué)、免疫學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)皮炎損傷程度，觀察BCG-PSN對(duì)小鼠皮損的預(yù)防作用。結(jié)果 出生后4周內(nèi)重復(fù)注射BCGPSN，可以顯著改善DNCB致敏Nc/Nga小鼠皮損炎癥程度，降低皮炎評(píng)分以及小鼠的搔抓行為，不同濃度BCGPSN組之間搔抓頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BCG-PSN可以降低血漿中IgE的含量，呈劑量依賴性。0.5 mg/kg BCGPSN可增加皮損中分泌干擾素（IFN）γ的細(xì)胞數(shù)量。不同劑量BCG-PSN均可降低脾單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4的含量，增加IL-12的濃度。結(jié)論 早期注射BCG-PSN可通過促進(jìn)分泌IFN-γ的細(xì)胞增生，增加IL-12合成，降低IL-4和IgE的含量，從而預(yù)防Nc/Nga小鼠皮炎發(fā)生。

皮炎，特應(yīng)性；小鼠，Nc/Nga；樹突細(xì)胞；卡介菌多糖核酸

卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）是從卡介菌中提取多糖、核酸混合而制成的新型免疫調(diào)節(jié)劑，我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BCG-PSN可以促進(jìn)AD患者PBMC中IL-12分泌，糾正Th1/Th2失衡狀態(tài)［1］。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BCG-PSN可能通過促進(jìn)IL-12和IFN-γ分泌，抑制IgE合成，發(fā)揮治療Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的作用［2］。早期注射BCG-PSN對(duì)于特應(yīng)性皮炎是否有預(yù)防作用，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究。我們采用日本Nc/Nga小鼠作為小鼠特應(yīng)性皮炎模型，觀察BCG-PSN對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎皮損的影響，旨在為早期注射BCG-PSN預(yù)防特應(yīng)性皮炎的發(fā)生提供依據(jù)。

材料和方法

一、動(dòng)物與試劑

從日本Charles River Laboratories公司購得6周齡SPF級(jí)Nc/Nga小鼠（合格證號(hào)110600109000211），自由交配，選擇出生24 h內(nèi)Nc/Nga幼鼠16只，3只母鼠所生，前4周以各自母鼠母乳喂養(yǎng)，4周后分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為清潔級(jí)環(huán)境，12 h光照/12 h黑暗，室溫為22～25℃，濕度為40%～70%，自由飲水進(jìn)食。BCG-PSN購于湖南九芝堂醫(yī)藥貿(mào)易有限公司，二硝基氯苯（DNCB）購于北京市化學(xué)試劑公司，兔抗小鼠IFN-γ抗體和羊抗兔IgG（二抗）購于武漢博士德生物工程有限公司，小鼠 IL－4、IL－12、IgE 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購于美國Invitrogen公司。

二、方法

1.給藥：16只Nc/Nga新生小鼠分為3個(gè)組，正常對(duì)照組4只，低濃度組（0.1 mg/kg BCG-PSN）5只，高濃度組（0.5 mg/kg BCG-PSN）7 只。鼠齡 1、8、15、22 d：正常對(duì)照組小鼠分別于皮下注射生理氯化鈉溶液，低濃度組小鼠分別注射0.1 mg/kg BCG-PSN，高濃度組小鼠分別皮下注射0.5 mg/kg BCG-PSN。

2.皮損誘導(dǎo)：參考DNCB誘發(fā)Nc/Nga小鼠皮炎的文獻(xiàn)稍有改進(jìn)［3-4］，鼠齡第49天，用含1%DNCB的丙酮溶液致敏各組Nc/Nga小鼠背部除毛后皮膚，第56、63、70天外用含0.1%DNCB的丙酮溶液進(jìn)行激發(fā)。試驗(yàn)過程中小鼠健康，未出現(xiàn)死亡。

3.觀察指標(biāo)：

（1）皮損嚴(yán)重程度：第 57、64、71 天觀察小鼠，進(jìn)行皮炎評(píng)分并拍照。皮炎評(píng)分按以下方法進(jìn)行：觀察皮膚紅斑、鱗屑、表皮干燥、結(jié)痂等情況，按嚴(yán)重程度計(jì)分：無癥狀計(jì)0分、輕微計(jì)1分、中度計(jì)2分、嚴(yán)重計(jì) 3分，計(jì)算所有癥狀的分?jǐn)?shù)［3］。

（2）小鼠搔抓行為：第 57、64、71天將小鼠單獨(dú)放置，觀察10 min內(nèi)小鼠搔抓耳部、背部的次數(shù)，連續(xù)搔抓算作1次。

（3）血清 IgE 含量：第 57、64、71天眼眶后靜脈取血，抗凝血在4℃下1 600×g離心30 min，獲取血漿，凍存于-20℃，待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子的濃度。

（4）Nc/Nga小鼠脾臟單一核細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-4、IL-12的含量：小鼠脫頸處死后，無菌取脾臟置于消毒平皿中；取脾臟單一核細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml，接種至24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后收集上清液。用ELISA方法檢測(cè)IL-4、IL-12的含量。

（5）組織病理：第72天處死小鼠后，背部皮損組織用4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變。

（6）Nc/Nga小鼠干擾素（IFN）γ的表達(dá)：用免疫組化法檢測(cè)小鼠組織病理中IFN-γ的表達(dá)水平。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示。多個(gè)樣本之間采用單因素方差分析，用方差齊性檢驗(yàn)，如方差不齊，采用Dunnetts T3方法進(jìn)行兩兩比較，如方差齊，采用Bonferroni分析，進(jìn)一步比較兩兩之間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.BCG-PSN對(duì)Nc/Nga小鼠皮炎評(píng)分的影響：早期接種BCG-PSN可以減輕由外用DNCB引起的皮炎。第57、64、71天，低濃度組皮炎評(píng)分與正常對(duì)照組相比，P值分別為 0.005、0.261、0.014，高濃度組與正常對(duì)照組相比，P值分別為0.000、0.002、0.000。第71天高濃度組與低濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＝ 0.013。見表1。

2.BCG-PSN對(duì)小鼠搔抓頻率的影響：早期注射低濃度BCG-PSN可以明顯降低DNCB致敏Nc/Nga小鼠搔抓頻率，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝ 0.000、0.007、0.000），高濃度 BCG-PSN 明顯降低搔抓頻率，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝ 0.00、0.00、0.00）。BCG-PSN兩個(gè)劑量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＝ 0.058、0.074、0.051。見表2。

3.Nc/Nga小鼠各組第57、64、71天血漿IgE含量：早期多次注射BCG-PSN可以降低血漿中IgE的含量。第57、64、71天，低濃度組與正常對(duì)照組相比，P值分別為0.000、0.000、0.000；高濃度組與正常對(duì)照組相比，P值分別為 0.000、0.000、0.000。高濃度BCG-PSN能更有效的降低血漿內(nèi)IgE的含量，第57、64、71天，高濃度組與低濃度組比較，P值分別為 0.001、0.009、1。見表 3。

表1 Nc/Nga小鼠各組不同時(shí)間皮炎評(píng)分（±s）

表1 Nc/Nga小鼠各組不同時(shí)間皮炎評(píng)分（±s）

注：a：與正常對(duì)照組比較，P ＜ 0.05；b：與低濃度組比較，P ＜ 0.05

組別 只數(shù) 57 d 64 d 71 d正常對(duì)照組 4 7±0.82 8.75±0.96 9.75±0.96低濃度組 5 4.8±0.84a 7.4±1.14a 7.6±1.14a高濃度組 7 4±0.82a 5.7±1.11a 5.71±0.78ab

表2 Nc/Nga小鼠各組搔抓頻率（±s）

表2 Nc/Nga小鼠各組搔抓頻率（±s）

注：a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 57 d 64 d 71 d正常對(duì)照組 4 5±0.82 6.75±0.96 8.5±0.58低濃度組 5 2.4±0.55a 4.2±0.84a 4.8±0.84a高濃度組 7 1.23±0.76a 2.7±1.11a 3.43±0.98a

4.Nc/Nga小鼠各組脾單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-4、IL-12的含量：Nc/Nga小鼠早期皮下注射低濃度、高濃度的BCG-PSN，均可降低DNCB激發(fā)的Nc/Nga小鼠脾臟單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4的含量，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.000、0.000?？稍黾覫L-12含量，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.000、0.000。高濃度BCG-PSN可明顯降低IL-4和提高IL-12的含量，與低濃度BCG-PSN比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.013、0.002，見表4。

表3 Nc/Nga小鼠各組第57、64、71天血漿IgE濃度（μg/L，±s）

表3 Nc/Nga小鼠各組第57、64、71天血漿IgE濃度（μg/L，±s）

注：a：與正常對(duì)照組比較，P ＜ 0.05；b：與低濃度組比較，P ＜ 0.05

組別 只數(shù) 57 d 64 d 71 d正常對(duì)照組 4 38.45±3.09 58.77±4.5 70.9±2.97低濃度組 5 25.2±4.77a 32.69±3.92a 39.38±4.8a高濃度組 7 16.09±1.9ab 24.38±3.51ab 37.15±4.68

表4 Nc/Nga小鼠各組單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-12的含量（ng/L，±s）

表4 Nc/Nga小鼠各組單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-12的含量（ng/L，±s）

注：a：與正常對(duì)照組比較，P ＜ 0.05；b：與低濃度組比較，P ＜ 0.05

組別 只數(shù) IL-4 IL-12正常對(duì)照組 4 50.26±5.24 19.78±5.11低濃度組 5 32.56±4.62a 36.44±3.48a高濃度組 7 23.91±3.39ab 47.81±4.43ab

5.Nc/Nga小鼠各組背部皮膚組織病理學(xué)：正常對(duì)照組小鼠組織病理提示有角化過度、棘層肥厚、基底細(xì)胞空泡化，真皮增厚、較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。早期多次注射低濃度BCG-PSN可以減少后期DNCB致敏Nc/Nga小鼠炎癥程度，表現(xiàn)為基底層細(xì)胞空泡化消失，真皮內(nèi)稀疏淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；早期多次注射高濃度BCG-PSN可以明顯減輕小鼠炎癥程度，組織病理圖片提示輕微角化過度，棘層恢復(fù)正常，真皮內(nèi)散在少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1～3。

6.Nc/Nga小鼠各實(shí)驗(yàn)組背部皮損IFN-γ的表達(dá)：用高濃度BCG-PSN早期處理Nc/Nga小鼠，經(jīng)DNCB致敏后，其真皮內(nèi)有較多分泌IFN-γ的細(xì)胞，低濃度BCG-PSN早期處理的小鼠和正常對(duì)照組小鼠真皮內(nèi)未見明顯的分泌IFN-γ的細(xì)胞。見圖4。

圖1 正常對(duì)照組小鼠背部組織角化過度、棘層肥厚、基底細(xì)胞空泡化，真皮增厚、較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×40）

圖2 低濃度組表現(xiàn)為基底層細(xì)胞空泡化消失，真皮內(nèi)稀疏淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×40）

圖3 高濃度組提示輕微角化過度，棘層恢復(fù)正常，真皮內(nèi)散在少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（HE×40）

圖4 Nc/Nga小鼠背部皮損干擾素γ的表達(dá)（免疫組化 ×40） 正常對(duì)照組（4A）及低濃度組（4B）小鼠真皮內(nèi)未見分泌IFN-γ的細(xì)胞，高濃度組（4C）小鼠真皮內(nèi)有較多分泌干擾素γ的細(xì)胞

討 論

一些研究結(jié)果表明，BCG-PSN是較強(qiáng)的Th1型細(xì)胞因子活化劑，可以促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)。林恩堯等［4］研究表明，經(jīng)BCG-PSN免疫的豚鼠，外周血的T淋巴細(xì)胞明顯增加，但是早期注射BCG-PSN是否可以防止過敏性疾病的發(fā)生未見相關(guān)報(bào)道。AD是一種慢性瘙癢性皮膚病，通常與過敏性鼻炎和哮喘等過敏性疾病相關(guān)［5-6］。Nc/Nga鼠是日本一種名叫Nishiki的寵物鼠，1997年Matsuda等對(duì)其進(jìn)行了基礎(chǔ)和臨床研究，正式確立它作為AD模型。當(dāng)Nc/Nga小鼠在普通環(huán)境下飼養(yǎng)時(shí)，它們?cè)诘?周開始出現(xiàn)搔抓行為，皮膚開始變得干燥并覆蓋鱗屑；在以后的幾個(gè)星期，小鼠的耳朵、背部、頸部和面部出現(xiàn)皮損。普通環(huán)境下Nc/Nga小鼠皮損免疫組化顯示有過度角化、棘層肥厚、角化不全，所有的這些表現(xiàn)與AD患者身上所觀察到的皮損非常相似［7-8］。小鼠皮損還提示有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒［9-11］。

我們前期實(shí)驗(yàn)［2］利用DNCB重復(fù)刺激Nc/Nga小鼠皮膚，成功的建立特應(yīng)性皮炎小鼠模型，由于部分小鼠在用5%DNCB刺激后，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的潰瘍、出血。為避免出現(xiàn)類似結(jié)果，我們將Nc/Nga小鼠背部毛發(fā)除掉后，涂抹1%的DNCB致敏，0.1%的DNCB重復(fù)刺激3次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組小鼠第1次重復(fù)刺激后，小鼠背部出現(xiàn)鱗屑、紅斑及皮膚干燥，第2次重復(fù)刺激后，小鼠背部出現(xiàn)紅斑、鱗屑，第3次重復(fù)刺激后，小鼠背部嚴(yán)重紅斑、厚痂。早期多次注射BCG-PSN可以緩解DNCB所致的皮炎嚴(yán)重程度，低濃度組小鼠早期出現(xiàn)少量抓痕和紅斑，后期皮膚干燥有較多鱗屑，未見明顯紅斑及結(jié)痂；高濃度組小鼠早期僅有皮膚干燥，后逐漸出現(xiàn)少許鱗屑。皮炎評(píng)分進(jìn)一步證實(shí)，BCG-PSN對(duì)于特應(yīng)性皮炎樣皮損有保護(hù)作用。早期多次注射低濃度和高濃度BCG-PSN可以明顯減少DNCB對(duì)成年Nc/Nga小鼠造成的搔抓行為，不同劑量BCG-PSN之間搔抓頻率無差異。我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，早期多次注射BCG-PSN可以降低Nc/Nga小鼠血漿中IgE的含量，呈劑量依賴性。組織病理學(xué)提示正常對(duì)照組小鼠有過度角化、棘層肥厚、基底細(xì)胞空泡化，真皮增厚、有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；早期多次注射低濃度的BCG-PSN可以減少后期DNCB致敏Nc/Nga小鼠炎癥程度，表現(xiàn)為基底層細(xì)胞空泡化消失，真皮內(nèi)淋巴細(xì)胞減少；早期多次注射高濃度BCG-PSN可以明顯減輕小鼠炎癥程度，組織病理圖片提示輕微角化過度，棘層恢復(fù)正常，真皮內(nèi)稀疏淋巴細(xì)胞。以上結(jié)果說明，早期多次注射BCG-PSN對(duì)于Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損炎癥程度的改善有益。

Sugiura等［12］檢測(cè)5～28周齡普通環(huán)境下飼養(yǎng)的Nc/Nga鼠，發(fā)現(xiàn)皮損中分泌IL-4和IL-5的細(xì)胞明顯增多，并且隨周齡增長(zhǎng)而增加，而分泌IFN-γ的細(xì)胞在21周前非常稀少，21周后才開始出現(xiàn)。Gately等［13］認(rèn)為IL-12在免疫反應(yīng)中可誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，對(duì)IL-4的產(chǎn)生起抑制作用，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)朝著Th1型方向發(fā)展。IFN-γ有抑制Th2類細(xì)胞因子IL-4，IL-5的產(chǎn)生，促使Th0向Th1分化，抑制其向Th2分化的作用，并可阻斷IgE的合成，減少嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化。IFN-γ可以加強(qiáng)IL-12誘導(dǎo)Th1細(xì)胞產(chǎn)生的能力，而IL-12本身又能誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。這樣，形成一個(gè)正反饋的調(diào)節(jié)，加強(qiáng)了Th1的免疫反應(yīng)，抑制了Th2的免疫反應(yīng)［14］。我們通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，高濃度BCG-PSN組小鼠皮損內(nèi)分泌IFN-γ的細(xì)胞大量出現(xiàn)，而單一核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4含量與正常對(duì)照組相比，明顯下降，IL-12的含量明顯增高。我們認(rèn)為早期多次皮下注射高濃度的BCG-PSN，可誘導(dǎo)分泌IFN-γ細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)IL-12分泌，抑制IL-4和IgE的合成，從而減輕皮損炎癥程度，發(fā)揮早期干預(yù)的作用。

［1］胡南,文海泉,肖嶸,等.卡介菌多糖核酸對(duì)特應(yīng)性皮炎患者PBMC產(chǎn)生嗜酸粒細(xì)胞活化趨化因子和CCR3的表達(dá)［J］.中華皮膚科雜志,2006,39（11）:657-658.

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Protective effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin against atopic dermatitis in Nc/Nga mice

Guo Yanan*,Wang Lili,Wen Haiquan,Ren Yong,Li Song.*Shandong Provincial Hospital,Shandong University,Jinan 250021,China

Li Song,Email:123250349@qq.com

Objective To evaluate the protective effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin（BCG-PSN）against atopic dermatitis（AD）in Nc/Nga mice,and to explore its possible mechanism.Methods Sixteen Nc/Nga mice were classified into normal control group （n=4）,low-concentration BCG-PSN group （n=5）and high-concentration BCG-PSN group （n=7）to be subcutaneously injected with sodium chloride physiological solution,BCG-PSN of 0.1 mg/kg and 0.5 mg/kg respectively,at 1,8,15 and 22 days of age.Dinitrochlorobenzene（DNCB）was repeatedly and topically applied to these Nc/Nga mice to induce AD-like lesions at 49 days of age.The preventive effect of BCG-PSN against AD was evaluated by dermatitis scores,scratching frequency,histopathological manifestations and immunological parameters（including IgE,interleukin（IL）-4 and-12,and interferon（IFN）-γ）.Results Repeated injection of BCG-PSN within 4 weeks after birth significantly decreased the severity of DNCB-induced AD-like lesions,dermatitis scores and scratching behavior in Nc/Nga mice.There was no statistical difference in scratching frequency between the high-and low-concentration BCG-PSN groups.BCG-PSN treatment reduced the plasma level of IgE in Nc/Nga mice in a dose-dependent manner.BCG-PSN at 0.5 mg/kg increased the number of cells secreting IFN-γ in skin lesions of mice.Both doses of BCG-PSN down-regulated IL-4 level,but up-regulated IL-12 level in the culture supernatant of spleen mononuclear cells from mice.Conclusion Early injection of BCG-PSN could protect Nc/Nga mice against dermatitis by promoting the proliferation of IFN-γsecreting cells,increasing the synthesis of IL-12,and reducing the levels of IL-4 and IgE.

Dermatitis,atopic;Mice,Nc/Nga;Dendritic cells;BCG-PSN

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.011

250021濟(jì)南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院（郭亞南、任勇、李頌）；濟(jì)南市第五人民醫(yī)院（王麗麗）；中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院（文海泉）

李頌，Email：123250349@qq.com

2014-06-24）

（本文編輯：吳曉初）