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環(huán)境因素對單增李斯特菌inlB毒力基因表達(dá)的影響

桑雪，朱耀磊，朱雅慧，張公亮，侯紅漫*
（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

針對單增李斯特菌毒力基因inlB設(shè)計(jì)五對引物，從中篩選出一對特異性強(qiáng)的引物，利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)來考察毒力基因表達(dá)的強(qiáng)弱。在不同環(huán)境因素條件下培養(yǎng)單增李斯特菌，分別提取菌體RNA，繼而合成cDNA，以管家基因16S rRNA為內(nèi)參基因，利用循環(huán)閾值（Ct）的變化計(jì)算inlB基因的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，毒力基因inlB在溫度為15℃、pH為6、氯化鈉濃度為1.5%～2.0%、蔗糖濃度為0.75%～1.25%時(shí)能高效表達(dá)；溫度為0℃和45℃、pH為4和9、氯化鈉濃度為3.5%以上以及蔗糖濃度為0%～0.25%和2.25%以上時(shí)，對毒力基因inlB的表達(dá)起明顯的抑制作用；在pH為6的條件下，酸的種類對毒力基因inlB的表達(dá)影響不大。

單增李斯特菌，毒力基因inlB，環(huán)境因素，基因表達(dá)

李斯特氏菌是兼性厭氧的革蘭氏陽性桿狀菌［1］，其中單增李斯特菌是一種可導(dǎo)致食源性疾病的致病菌，廣泛存在于蛋、禽、水產(chǎn)品、乳制品、肉、蔬菜等我們?nèi)粘５氖称分校?-3］。食物較易被單增李斯特菌污染，其中乳制品及肉中的污染檢出率最高。目前在世界的很多國家都發(fā)生過因該菌引起的中毒事件，感染該菌后臨床表現(xiàn)多樣化，其病的主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多，該菌的致病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他食源性細(xì)菌［4］。

致病的毒力基因常成簇狀，扎堆形成毒力島［5］。單增李斯特菌即由100個(gè)大小不一的毒力島組成，其中單增李斯特菌的內(nèi)化素島主要參與誘導(dǎo)、粘附、侵襲，構(gòu)成了一個(gè)基因家族系：inlA～inlH，基因家族系中inlA和inlB基因有著重要的作用，它們是最早鑒定出的與細(xì)菌侵襲相關(guān)的毒力因子，是被非吞噬細(xì)胞內(nèi)化所必需，為單增李斯特菌特有，其對單增李斯特菌具有鑒別意義［6］。毒力基因inlB屬于內(nèi)化素家族，具有受體特異性，能與肝細(xì)胞生長因子受體結(jié)合，是肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞的介導(dǎo)因素等。缺失inlB基因的單增李斯特菌毒力株的毒力嚴(yán)重下降。國內(nèi)外在環(huán)境因素對致病菌毒力影響方面也有了一定的研究［7-8］，本文選取的inlB基因，是單增李斯特菌很重要的產(chǎn)毒基因之一，且國內(nèi)外對其研究較少，但其表達(dá)的強(qiáng)弱也直接影響了單增李斯特菌的毒性強(qiáng)弱。本文主要研究常見食品加工條件，如溫度、pH、氯化鈉濃度、蔗糖濃度和酸的種類對inlB基因表達(dá)量的影響，以期能初步了解食品加工環(huán)境因素的變化對單增李斯特菌毒力的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種單增李斯特菌ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、ATCC 15313、威氏李斯特菌CICC 21672和格氏李斯特菌CICC 21670；副溶血性弧菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌本實(shí)驗(yàn)室保存菌株；SYBR?Premix Ex TaqTM、Oligo（dT）15Primer、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RTase M-MLV（RNase H-）等購自寶生物工程（大連）有限公司；20×PBS緩沖溶液、RNase Free dH2O、熒光定量PCR用引物等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒以及溶菌酶等購自北京天根生化有限公司；胰蛋白胨、磷酸氫二鉀、大豆蛋白胨、酵母膏、氯化鈉、葡萄糖、醋酸、乳酸、檸檬酸、鹽酸等購自博諾試劑。

熒光定量PCR儀美國BIO-RAD公司；高速離心機(jī)德國Eppendorf公司；水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1單增李斯特菌的培養(yǎng)含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB-YE）［9］：胰蛋白胨1.7 g，磷酸氫二鉀0.25 g，大豆蛋白胨0.3 g，酵母膏0.6 g，氯化鈉0.5 g，葡萄糖0.25 g，去離子水100 mL，pH7.5。培養(yǎng)條件為37℃，160 r/min培養(yǎng)20 h。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)及篩選利用NCBI與FastPCR軟件相結(jié)合，要滿足如下條件：21～26個(gè)堿基；前面以G/C開頭（數(shù)值在45%～60%），A/T結(jié)尾；Tm=50～60且一對引物的Tm值相差不超過3℃；檢測時(shí)不產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)；Quality值較理想。

根據(jù)以上條件設(shè)計(jì)了五對引物，見表1，再將每對引物分別與單增李斯特菌、格氏李斯特菌、威氏李斯特菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、產(chǎn)氣桿菌這幾株細(xì)菌分別進(jìn)行特異性檢測，最終篩選出了一對特異性強(qiáng)的引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3模板的制備

1.2.3.1細(xì)菌RNA的提取取適量菌液按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行RNA提取，于-80℃條件下保存。

1.2.3.2cDNA的合成反應(yīng)體系6 μL，包括：模板RNA（RNA定量到1 ng），Oligo（dT）Primer 1 μL，RNase free dH2O，混勻；反應(yīng)條件：70℃10 min；4℃2 min。

反應(yīng)體系10 μL，包括：以上模板RNA變性溶液6 μL，5×M-MLV Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.5 μL， RNase Inhibitor 0.25 μL，RTase M-MLV（RNase H-）0.5 μL，RNase Free dH2O 0.75 μL，反應(yīng)條件：42℃60 min；70℃15 min；4℃2 min；4℃保存。

1.2.4熒光定量PCR檢測反應(yīng)體系及條件25 μL擴(kuò)增體系：2倍濃度的SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μL；濃度為10 μmol/L的引物對各0.5 μL；Cdna模板2 μL；滅菌雙蒸水9.5 μL。

反應(yīng)參數(shù)：95℃30 s；95℃5 s，63.3℃25 s；72℃15 s；80℃15 s，40個(gè)循環(huán)；60～95℃建立熔解曲線。

1.2.5環(huán)境因素對毒力基因inlB表達(dá)的影響為了研究毒力基因inlB的表達(dá)，在不同環(huán)境因素條件下培養(yǎng)單增李斯特菌，每個(gè)條件作三個(gè)平行樣本和一個(gè)對照樣本，繼而分別提取RNA，并對所有樣品RNA均一化處理，合成cDNA，以管家基因16S rRNA為內(nèi)參基因。方程2-ΔΔCt用來作為判定inlB表達(dá)量的依據(jù)，其中37℃、pH7.5、葡萄糖0.25%、氯化鈉0.5%作為對照。本文環(huán)境因素的選擇均是事先經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的在單增李斯特菌能夠良好生長的條件范圍內(nèi)選取，利用熒光定量PCR技術(shù)分別得到每一個(gè)環(huán)境因素的循環(huán)閾值（Ct）的變化，從而計(jì)算inlB基因的相對表達(dá)量。

1.2.5.1溫度對inlB基因表達(dá)的影響分別在0、5、10、15、20、25、30、37、40、45℃條件下，培養(yǎng)單增李斯特菌20 h，其他條件見1.2.1，繼而分別提取RNA、合成cDNA，最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.5.2pH對inlB基因表達(dá)的影響分別在pH=4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9條件下，培養(yǎng)單增李斯特菌20 h，每個(gè)條件作三個(gè)平行樣本，其他條件見1.2.1，繼而分別提取RNA、合成cDNA，最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.5.3氯化鈉濃度對inlB基因表達(dá)的影響分別在氯化鈉濃度為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%（即加入氯化鈉0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 g）條件下，培養(yǎng)單增李斯特菌20 h，每個(gè)條件作三個(gè)平行樣本，每個(gè)條件作三個(gè)平行樣本，其他條件見1.2.1，繼而分別提取RNA、合成cDNA，最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.5.4蔗糖濃度對inlB基因表達(dá)的影響分別在蔗糖濃度為0%、0.25%、0.75%、1.25%、1%、1.75%、2.25%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%、17%、19%、21%（不加葡萄糖且分別加入蔗糖0、0.25、0.75、1.25、1、1.75、2.25、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 g）條件下，培養(yǎng)單增李斯特菌20 h，每個(gè)條件作三個(gè)平行樣本，其他條件見1.2.1，繼而分別提取RNA、合成cDNA，最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.5.5酸的種類對inlB基因表達(dá)的影響分別選取醋酸（6 mol/L）、乳酸（85%～90%）、檸檬酸（1%）和鹽酸（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6，對單增李斯特菌培養(yǎng)20 h，每個(gè)條件作三個(gè)平行樣本，其他條件見1.2.1，繼而分別提取RNA、合成cDNA，最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1引物設(shè)計(jì)

以單增李斯特菌毒力基因inlB為靶基因設(shè)計(jì)了五對引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所用引物序列見表1。

表1　目的基因與對應(yīng)引物序列Table 1　Target gene and corresponding primer sequences

2.2引物的特異性檢測

用5對引物分別對單增李斯特菌ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、ATCC 15313、威氏李斯特菌CICC 21672、格氏李斯特菌CICC 21670、副溶血性弧菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌共11株細(xì)菌進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，經(jīng)過篩選，引物inlB1、inlB2特異性較強(qiáng)，如圖1所示，只有單增李斯特菌ATCC 19111、單增李斯特菌ATCC 19112、單增李斯特菌ATCC 19115和單增李斯特菌ATCC 15313有擴(kuò)增曲線，其他7株細(xì)菌沒有擴(kuò)增曲線，說明可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　引物inlB1、inlB2擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　The amplification results of primer inlB1 and inlB2

2.3溫度對inlB基因表達(dá)的影響

由圖2可知，溫度為15℃條件下的相對表達(dá)量顯著高于其他不同溫度條件下的相對表達(dá)量（p＜0.01），inlB基因的表達(dá)較好；溫度為0、45℃條件下相對表達(dá)量顯著低于其他不同溫度條件下的相對表達(dá)量（p＜0.05），對inlB基因的表達(dá)量較低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫條件下，inlB基因表達(dá)量較高，并不會影響單增李斯特菌的產(chǎn)毒性能。在溫度對毒力基因inlB表達(dá)的影響方面，Gonzalez-Serrano等［10］也指出低溫條件下毒力基因的表達(dá)量是高于28℃和37℃條件下的毒力基因表達(dá)量的，其結(jié)論與本文得到的結(jié)果是一致的。

圖2　溫度對inlB基因表達(dá)的影響Fig.2　Effect of temperature on inlB expression

2.4pH對inlB基因表達(dá)的影響

由圖3可知，pH=6條件下的相對表達(dá)量極顯著高于其他pH條件下的相對表達(dá)量（p＜0.01），inlB基因的表達(dá)較好；pH=4和pH=9條件下的相對表達(dá)量明顯低于其他pH條件下的相對表達(dá)量（p＜0.05），對inlB基因的表達(dá)起抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在酸堿性較強(qiáng)的條件下，inlB基因相對表達(dá)較弱。

圖3　pH對inlB基因表達(dá)的影響Fig.3　Effect of pH on inlB expression

2.5氯化鈉濃度對inlB基因表達(dá)的影響

由圖4可知，氯化鈉濃度在0%～1.5%所對應(yīng)的inlB基因表達(dá)量是遞增的，而氯化鈉濃度由1.5%～4.0%對應(yīng)的inlB基因表達(dá)量是遞減的。氯化鈉濃度為1.5%和2.0%條件下的相對表達(dá)量極顯著高于其他氯化鈉濃度條件下的相對表達(dá)量（p＜0.01），inlB基因的表達(dá)較好；氯化鈉濃度為4.0%條件下的相對表達(dá)量（相對表達(dá)量為0.016034）顯著低于其他氯化鈉濃度條件下的相對表達(dá)量（p＜0.05），對inlB基因的表達(dá)起抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低鹽度的條件下，能一定程度的促進(jìn)inlB基因的表達(dá)，高鹽度條件下抑制inlB基因的表達(dá)。

圖4　氯化鈉濃度對inlB基因表達(dá)的影響Fig.4　Effect of NaCl concentration on inlB expression

圖5　蔗糖濃度（0%～2.25%）對inlB基因表達(dá)的影響Fig.5　Effect of saccharose concentration（0%～2.25%）on inlB expression

2.6蔗糖濃度對inlB基因表達(dá)的影響

由圖5可知，蔗糖濃度為0.75%和1.25%條件下的相對表達(dá)量高于其他蔗糖濃度條件下的相對表達(dá)量，inlB基因的表達(dá)較好；蔗糖濃度為0%、0.25%和2.25%條件下的相對表達(dá)量低于其他蔗糖濃度條件下的相對表達(dá)量，對inlB基因的表達(dá)有一定的抑制。

圖6　蔗糖濃度（1%～21%）對inlB基因表達(dá)的影響Fig.6　Effect of saccharose concentration（1%～21%）on iinlB expression

在單增李斯特菌能夠良好生長的條件范圍內(nèi)，選取了1%～21%的蔗糖濃度進(jìn)行對inlB基因表達(dá)情況的研究，由圖6可知，蔗糖濃度為1%條件下的相對表達(dá)量極顯著高于其他蔗糖濃度條件下的相對表達(dá)量（p＜0.01），inlB基因的表達(dá)較好；而蔗糖濃度為3%～21%條件下的相對表達(dá)量均較低。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低蔗糖濃度條件下，能夠一定程度的促進(jìn)inlB基因的表達(dá)，高蔗糖濃度的條件下抑制inlB基因的表達(dá)。

圖7　酸的種類對inlB基因表達(dá)的影響Fig.7　Effect of various acids on inlB expression

2.7酸對inlB基因表達(dá)的影響

分別選取醋酸、乳酸、檸檬酸和鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為6，其中，乳酸、醋酸、檸檬酸為有機(jī)酸，鹽酸為無機(jī)酸。由圖7可知，在pH為6的條件下，酸的種類對inlB的表達(dá)沒有顯著的差異性。有關(guān)酸的種類對毒力基因表達(dá)的研究也有相關(guān)報(bào)道，Scott E Hanna等［7］報(bào)道，選取醋酸、乳酸和鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為5，其對毒力基因inlA表達(dá)沒有差異性，其結(jié)論與所得結(jié)果一致。

3　結(jié)論

inlB基因高效表達(dá)的pH為6的條件下，酸的種類對毒力基因inlB的表達(dá)沒有明顯的差異。毒力基因inlB在溫度為15℃、pH為6、氯化鈉濃度為1.5%～2.0%、蔗糖濃度為0.75%～1.25%時(shí)能高效表達(dá)；溫度為0℃和45℃、pH為4和9、氯化鈉濃度為3.5%以上以及蔗糖濃度為0%～0.25%和2.25%以上時(shí)，對毒力基因inlB的表達(dá)起明顯的抑制作用；在pH為6的條件下，酸的種類對毒力基因inlB的表達(dá)影響不大。

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Effect of environmental factors on Listeria monocytogenes inlB gene expression

SANG Xue，ZHU Yao-lei，ZHU Ya-hui，ZHANG Gong-liang，HOU Hong-man*
（School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Five pairs of primers were designed based on Listeria monocytogenes virulence genes inlB and a pair of well specific primers were selected for this study.The Listeria monocytogenes virulence factor expression was studied by real-time reverse transcriptase PCR.RNAs were extracted from Listeria monocytogenes culture solution under the different environmental factors conditions，and then cDNAs were synthesized respectively. The housekeeping gene 16S rRNA was used as an internal standard.The changes of the Ct value could mirror the relative expression levels of inlB gene.Our data suggested that inlB gene expression was efficient when the temperature was 15℃，pH was 6，the NaCl concentration was 1.5%to 2%，and the concentration of sucrose was 0.75%to 1.25%.When the temperature was 0℃ or 45℃，pH was 4 or 9，the NaCl concentration was more than 3.5%，and the concentration of sucrose was 0%to 0.25%，or more than 2.25%，inlB gene expression was suppressed.What’s more，the kinds of acid had little effect on the inlB gene when the pH was 6.

Listeria monocytogenes；virulence genes inlB；environmental factors；gene expression

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.028

2015－01－06

桑雪（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測，E-mail：sangxue116@sina.com。

侯紅漫（1964-），女，教授，研究方向：微生物技術(shù)，E-mail：houhongman@dlpu.edu.cn。

遼寧省高校重大科技平臺（遼教發(fā)［2011］191號）；遼寧省特聘教授（遼教發(fā)［2012］145號）。