趙曉會(huì)　劉元金

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2.華蘭生物，河南 新鄉(xiāng) 453000）

纖維素降解過(guò)程中微生物群落的1166 SS rDNA-PCR
--DDGGGGEE分析

趙曉會(huì)1劉元金2

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2.華蘭生物，河南 新鄉(xiāng) 453000）

采用兼性厭氧法篩選出一高效降解纖維素的復(fù)合微生物菌群，提取不同培養(yǎng)時(shí)間條件下降解菌體系的總DNA，并以其為模板采用PCR-DGGE技術(shù)研究了在纖維素降解過(guò)程中微生物群落的組成，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的不同，微生物的群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出差異。

纖維素降解菌；微生物群落；PCR-DGGE

纖維素是地球上蘊(yùn)藏量最多的一類可再生資源，廣泛存在于綠色植物中［1］。隨著石油資源的不斷枯竭，人們開(kāi)始紛紛將目光投入到纖維素的降解上。纖維素分子一般是由D-六環(huán)葡萄糖殘基通過(guò)β-1，4-糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成的鏈狀結(jié)構(gòu)體，其致密的結(jié)構(gòu)，使得纖維素很難被降解［2］。每年有大量的秸稈被焚燒掉，這不僅造成了纖維素的白白浪費(fèi)，還造成了環(huán)境污染［3］。纖維素主要是由能分泌纖維素酶微生物來(lái)降解的。在降解效率上，相對(duì)于單一菌株，微生物菌群因存在著協(xié)調(diào)作用而優(yōu)勢(shì)更為明顯［4］，因此在纖維素降解過(guò)程中，菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化成為當(dāng)下研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

DGGE即變性梯度凝膠電泳是由Fischer和lerrnan于1979年最先提出的，可檢測(cè)到一個(gè)核苷酸水平的差異，主要用于檢測(cè)DNA突變。由于DGGE技術(shù)可以反映出不可培養(yǎng)菌的存在，因而在分析上更為準(zhǔn)確客觀。通過(guò)電泳條帶直接再現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)，從而使其成為研究微生物群落遺傳多樣性和動(dòng)態(tài)性的強(qiáng)有力工具［5］。本實(shí)驗(yàn)采用兼性厭氧法篩選出一高效降解纖維素的土壤樣品，擬采用DGGE的方法對(duì)其纖維素降解過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析［6］。

1　材料與方法

1.1材料

復(fù)合菌群，篩自實(shí)驗(yàn)室所存土壤樣品；Ex Taq，DL2000 DNA Marker，dNTP（10 mM each），購(gòu)自大連寶生物；DNA產(chǎn)物純化試劑盒，購(gòu)自北京天根生化有限公司。

復(fù)篩（發(fā)酵）培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，酵母粉1，濾紙5，氯化鈉5，碳酸鈣2，土壤浸提液10mL（土壤與去離子水以1∶1（質(zhì)量比）進(jìn)行混勻，60℃溫浴2h，過(guò)濾滅菌后備用），調(diào)節(jié)pH為8.0。

1.2方法

1.2.1復(fù)合菌群的獲得

將所篩土壤樣品接種至復(fù)篩液體培養(yǎng)基中，在一個(gè)降解周期內(nèi)每12h取1次樣，每次取1mL，共取11次。

1.2.2菌群中總DNA的提取

菌群總DNA具體提取步驟參考文獻(xiàn)7，提取后置于-20℃冰箱中保存［7］。

1.2.3PCR擴(kuò)增

將提取的細(xì)菌菌群總DNA作模板，并使用16SV3區(qū)通用引物357F：5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCCCCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'；518R：5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'［8］為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（50μl）：10×PCR buffer5.0μl、2.5mMdNTPs 2.0μl、Primer 357F（10μM）2.0μl、Primer 518R（10μM）2.0μl、ExTaq（5 U/μL）0.5μl、Template1.0μl、ddH2O37.5μl；退火溫度57℃。

1.2.4DGGE實(shí)驗(yàn)分析

將獲得的16S V3區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳分離。凝膠的制備采用梯度混合裝置進(jìn)行灌膠，其中聚丙烯酰胺濃度為10%，變性劑濃度從上方的40%逐漸遞增到下方的50%，待凝膠反應(yīng)凝固后取10ul的上樣緩沖液和5ul樣品充分混勻后加入到上樣槽中，電泳溫度設(shè)置為60℃，電壓為150V，待上樣緩沖液的第二條指示帶跑出凝膠時(shí)立即停止電泳。取出凝膠，置于溴化乙錠（EB）中染色15-20min，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.116SrDNA V3區(qū)擴(kuò)增PCR結(jié)果

圖1　16SrDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)V3區(qū)的通用引物擴(kuò)增出來(lái)的16S rDNA片斷大小大概為220bp，由圖1可以看出，各樣品在Marker中靠近250bp條帶下方都有一條特別明亮的條帶，其大小與目的條帶相差無(wú)幾。因此說(shuō)明經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出16SrDNA V3區(qū)片斷符合預(yù)期，但在拖尾中也可看出含有少量的雜帶，需要對(duì)V3的特異條帶進(jìn)行切膠純化后才能進(jìn)行DGGE分析。

2.2DGGE圖譜分析

將上述純化后PCR產(chǎn)物上樣于DGGE凝膠中。從圖2中可以看出同一大小的樣品經(jīng)電泳后分出了十多條，其中以標(biāo)出的七條條帶較為清楚。條帶1、5、6和7都是隨著降解纖維素的時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減淡，這說(shuō)明其由最初的優(yōu)勢(shì)菌株逐漸變成次要菌株；而條帶3和4在整個(gè)降解周期中亮度始終明亮，表明其在整個(gè)降解過(guò)程中地位不變。條帶2最為特殊，在降解初期基本沒(méi)有出現(xiàn)，而從降解中期（60h）開(kāi)始逐漸變亮，它代表的是后期成長(zhǎng)起來(lái)的優(yōu)勢(shì)菌株。

圖2　DGGE圖譜Fig.2DGGE fingerprint

3　結(jié)論

DGGE電泳充分反映了在降解周期中菌群的變化情況，證明了在纖維素降解不同階段處于主導(dǎo)地位的菌株是不同的。結(jié)合一個(gè)降解周期中菌群的變化可以看出：條帶1、5、6和7代表的菌株是篩選分泌產(chǎn)纖維素酶的目標(biāo)菌株，在早期的培養(yǎng)基中纖維素含量較大，在此誘導(dǎo)下，能分泌纖維素酶的菌株會(huì)生長(zhǎng)較快，反映在DNA水平上就是條帶較為明亮。隨著纖維素不斷被水解成葡萄糖，他們可能會(huì)受到葡萄糖效應(yīng)的抑制而逐漸退化。而另一些可以利用葡萄糖的菌株（條帶2代表的菌株）開(kāi)始成為菌群中的主要成員，其生長(zhǎng)又可能進(jìn)一步改變了培養(yǎng)基的環(huán)境，使得其最終在菌群中占了主導(dǎo)地位。條帶3和4代表的菌株在整個(gè)周期中都大量存在，這說(shuō)明其既可以發(fā)酵纖維素也可以利用葡萄糖，又具有一定的環(huán)境耐受性，它們可能是未來(lái)篩選降解纖維素最佳菌株。

［1］周曉云.酶技術(shù)［M］.北京：石油出版社.1995：224-230.

［2］Gonzalez J，Weiner R.Phylogenetic characterization of amarinebacteriumstrain2-40，adegraderofcomplex polysaccharides［J］.InternationalJournalofSystematic Bacteriology，2000（8）：831-834.

［3］李日強(qiáng)，辛小蕓.天然秸稈纖維素分解菌的分離選育［J］.上海環(huán)境科學(xué)，2002，21（l）：8.

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［6］Gonzalez.J，Weiner R.Phylogenetic characterization of amarinebacteriumstrain2-40，adegraderofcomplex polysaccharides［J］.InternationalJournalofSystematic Bacteriology，2000（8）：831-834.

［7］ZhouJL.Distributionofpolycyclicaromatic hydrocarbons in water and surface sediments from Data Bay［J］. China Environmental Pollution.2003，12（1）：269-281.

［8］吳鑫.DGGE指紋圖譜分析太湖富營(yíng)養(yǎng)化水體中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化［D］.上海：上海交通大學(xué)，2007.

Analysis of Bacterial Communities during Cellulose Degradation by 16SrDNA-PCR-DGGE

Zhao Xiaohui1Liu Yuanjin2
（1.Sanquan Medical College，Xinxiang Medical University，Xinxiang Henan 453000；2.Hualan Bio-engineering，Xinxiang Henan453000）

A highly effective complex microbial community in cellulose degradation was selected and obtained through afacultative anaerobic.The bacterial DNA was extracted under different cultivation time conditions，and the composition of microbial community in cellulose degradation was studied by PCR-DGGE technology based on the above module.The results showed that there were different structures of microbial community with changing cultivation time.

Cellulasedegradation；Microbial community；PCR-DGGE；

S141.4

A

1003-5168（2015）05-0133-3

2015-4-28

趙曉會(huì)（1986.3-），女，碩士，助教，研究方向：微生物學(xué)。