韓玉竹，鄧 釗，張 寶，游成真，叢 苑，李平蘭，*

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科學(xué)系，重慶 402460；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué) 院，北京 100083）

解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件優(yōu)化和提取方法比較研究

韓玉竹1，2，鄧 釗2，張 寶2，游成真2，叢 苑2，李平蘭2，*

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科學(xué)系，重慶 402460；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué) 院，北京 100083）

以尖孢鐮刀菌為指示菌，無(wú)菌濾液抑菌圈直徑為考察指標(biāo)，對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15所產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵和提取條件進(jìn)行優(yōu)化。獲得優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基為L(zhǎng)-1培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)條件為：接種量3%、初始pH 6.68、培養(yǎng)溫度30.79 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48.61 h、轉(zhuǎn)速160 r/min。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液抑菌圈直徑可高達(dá)25.21 mm，比優(yōu)化前（16.40 mm）提高了53.48%。以4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢(shì)霉菌（草酸青霉、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、黑曲霉）為指示菌，比較分析不同質(zhì)量濃度硫酸銨沉淀和鹽酸沉淀不同有機(jī)溶劑抽提對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15抗菌肽提取的影響，結(jié)果均表明鹽酸沉淀丙酮抽提法獲得的抗菌肽活性最高。

抗菌肽；解淀粉芽孢桿菌；發(fā)酵條件；提取方法

霉菌侵染是玉米貯藏過(guò)程中的主要問(wèn)題［1］，不僅會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失，而且霉菌代謝產(chǎn)生的真菌毒素及其他有毒代謝產(chǎn)物會(huì)嚴(yán)重危害人類健康［2］。目前，為保障糧食在儲(chǔ)藏過(guò)程不易發(fā)生霉變，傳統(tǒng)方法一般是在糧食表面噴灑化學(xué)防霉劑，暴露出很多安全問(wèn)題。目前，尋找天然高效的生物類抗菌物質(zhì)已成為糧食防霉研究的熱點(diǎn)［3］。

芽孢桿菌（Bacillus spp.）生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、抗逆性強(qiáng)，可以產(chǎn)生多肽類抗菌素以及具有溶菌作用的酶類，作為自然界中廣泛存在的非致病菌，絕大多數(shù)芽孢桿菌對(duì)人畜無(wú)害且不會(huì)造成環(huán)境污染。因此，芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物，是目前控制真菌病害最為安全有效和最具應(yīng)用前景的天然生物制劑，已應(yīng)用于植物病害生物防治和生鮮農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮的研究中，但在糧食防霉上的應(yīng)用探索較少［4］。

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)玉米中攜帶的霉菌種類進(jìn)行分離鑒定［5］，并篩選出多株對(duì)霉菌生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)有強(qiáng)烈抑制作用的芽孢菌株，其分泌的抑菌物質(zhì)較糧食中使用的常規(guī)化學(xué)防腐劑更能有效地抑制玉米儲(chǔ)藏過(guò)程中的霉菌生長(zhǎng)，保障糧食安全［6-7］。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）H15是前期實(shí)驗(yàn)室篩選的具有較強(qiáng)拮抗糧食霉變真菌的菌株之一，并已明確產(chǎn)生抗菌肽是其拮抗病原真菌的主要機(jī)制之一。但抗菌肽的產(chǎn)量和活性受環(huán)境條件如溫度、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)基組成等的影響很大，因而，對(duì)其發(fā)酵條件的研究顯得十分重要［8］。同時(shí)抗菌肽的獲得會(huì)受到抗菌物質(zhì)提取方法的影響，選擇合適的提取方法，能節(jié)省原料簡(jiǎn)化步驟，增加抗菌物質(zhì)的獲得量。本實(shí)驗(yàn)以該菌株為研究對(duì)象，對(duì)其產(chǎn)抗菌肽發(fā)酵和提取條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得該菌代謝產(chǎn)抗菌肽的最適宜條件，以期為該菌株在工業(yè)上大量生產(chǎn)高活性的抗菌肽提供一定的實(shí)踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）H15，專利保藏用名ivfcaas0003，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室保藏菌種，專利保藏號(hào)為CGMCC 8230。

指示菌：4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢(shì)霉菌［5，9］：草酸青霉（Penicillium oxalicum）ACCC 32576、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）ACCC 36127、黑曲霉（Aspergillus niger）ACCC 30005、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）ACCC 37438，為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物研究室保藏菌種。

1.2發(fā)酵上清液的制備

以NB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，按3%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，三角瓶裝液量200 mL/500 mL，在30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心10 min去除菌體細(xì)胞，用細(xì)菌濾器（0.22 μm）過(guò)濾，得到發(fā)酵液的無(wú)菌濾液，對(duì)其進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

1.3抑菌活性的測(cè)定

采用牛津杯雙層瓊脂平板擴(kuò)散-抑菌圈法測(cè)定上清液的抑菌活性。具體為：以尖孢鐮刀菌為指示菌，將其在PDA斜面上活化，28 ℃培養(yǎng)7 d，加入滅菌水后刮取孢子，配制成濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液。吸取1 mL孢子懸浮液至培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）中，倒入20 mL冷卻到45 ℃的PDA培養(yǎng)基，搖勻，制成含菌平板。在滅菌的牛津杯里加入100 μL無(wú)菌濾液，置28 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后測(cè)量抑菌圈直徑。以孔中加入空白培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理重復(fù)3 次。

1.4培養(yǎng)基的篩選

實(shí)驗(yàn)選用5 種常用細(xì)菌培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL；LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL；BPY培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖10.0 g，蒸餾水1 000 mL；NYD培養(yǎng)基：牛肉膏8.0 g、酵母膏3.0 g、葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 000 mL；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

選用5 種解淀粉芽孢桿菌抗菌物質(zhì)發(fā)酵優(yōu)化后的培養(yǎng)基：YSB培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g、酵母膏20.0 g、牛肉膏15 g、MgSO4·7H2O 0.06 g、FeSO4·7H2O 0.009 g，蒸餾水1 000 mL［10］；Landy培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、L-谷氨酸鈉5.0 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL；Landy優(yōu)化培養(yǎng)基1（L-1）：葡萄糖42.0 g、L-谷氨酸鈉14.0 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL［11］；Landy優(yōu)化培養(yǎng)基2（L-2）：葡萄糖10.0 g、L-谷氨酸鈉5.0 g、MgSO40.5 g、KCl 0.78 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.05 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL［12］；Landy優(yōu)化培養(yǎng)基3（L-3）：葡萄糖8.13 g、L-谷氨酸鈉4.2 g、NH4NO36.14 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO44.87 mg、CaCl23.98 g、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL［13］。

上述培養(yǎng)基pH值均為7.0～7.2。

1.5發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.5.1接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

分別以0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15，發(fā)酵初始pH值為7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.5.2發(fā)酵初始pH值對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15，發(fā)酵初始pH值分別設(shè)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.5.3培養(yǎng)溫度對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15，發(fā)酵初始pH 7.0，培養(yǎng)溫度分別設(shè)為20、25、30、35、40 ℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.5.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15、發(fā)酵初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃，分別在不同培養(yǎng)時(shí)間（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h）取樣并測(cè)定發(fā)酵液的OD600nm值和抑菌活性。

1.5.5轉(zhuǎn)速對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15、發(fā)酵初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h，轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100、120、140、160、180、200 r/min，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.6響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)抑菌活性影響最顯著的3 個(gè)因素（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值）為自變量，以無(wú)菌濾液的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合原理設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7模型的驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件，并以優(yōu)化后的條件參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，比較模型預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值，驗(yàn)證模型的有效性。

1.8抗菌肽提取方法

1.8.1硫酸銨沉淀法

取100 mL發(fā)酵上清液，冰浴條件下，邊攪拌邊緩慢向上清中添加經(jīng)過(guò)研磨的硫酸銨粉末，使銨離子終質(zhì)量濃度分別達(dá)到20、30、40、50、60、70、80、90 g/100 mL，并放置4 ℃冰箱中過(guò)夜。10 000 r/min離心10 min，離心所得沉淀即為沉淀蛋白，分別向沉淀物中添加相同體積（發(fā)酵液濃縮5 倍）20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液使沉淀溶解后測(cè)定抑菌活性［14-16］。

1.8.2鹽酸沉淀有機(jī)溶劑抽提法

取發(fā)酵液100 mL冰浴條件下，邊攪拌邊緩慢向上清中添加6 mol/L HCl，調(diào)整pH值至2.0，在4 ℃條件下靜置過(guò)夜。沉淀的蛋白質(zhì)在10 000 r/min離心10 min，沉淀分別用5 倍體積的甲醇［17］、丙酮［18］、乙醇、正丁醇［19］、乙酸乙酯［20］抽提。抽提后10 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀用同 種有機(jī)溶劑再次抽提，離心除去沉淀。合并兩次的抽提液，通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干有機(jī)溶劑后，即為粗提物。用相同體積（發(fā)酵液濃縮5 倍）20 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解后測(cè)定抑菌活性。

1.9數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基的篩選

圖1　不同培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different media on the antifungal activity of fermented broth

由圖1可知，在同等發(fā)酵條件下，采用YSB和L-1培養(yǎng)基都可獲得相對(duì)較高活性的抗菌肽，兩者之間沒有顯著差異（P＜0.05）。其次為L(zhǎng)-3、L-2、BPY培養(yǎng)基。但考慮到L-1培養(yǎng)基主要由谷氨酸鈉和無(wú)機(jī)鹽組成，成分相對(duì)簡(jiǎn)單，后續(xù)抗菌物質(zhì)分離容易，成本低。因此，采用L-1培養(yǎng)基作為進(jìn)一步試驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1培養(yǎng)時(shí)間的影響

圖2　解淀粉芽孢桿菌H15的生長(zhǎng)及抑菌活性曲線Fig.2 Growth and antifungal activity curves of B. amyloliquefaciens H15

由圖2可知，菌株H15在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（12 h）已產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，進(jìn)入穩(wěn)定期后抗菌活性持續(xù)增加，48 h時(shí)分泌的抗菌物質(zhì)活性達(dá)到最大值。此后，抗菌物質(zhì)的活性下降。通常認(rèn)為抗菌肽的產(chǎn)生與生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)，有些抗菌肽在細(xì)胞開始生長(zhǎng)時(shí)即可產(chǎn)生，而有些抗菌肽則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期才會(huì)產(chǎn)生。該抗菌肽在生長(zhǎng)到一定時(shí)間（48 h）后抑菌活性降低，這可能是由于菌體生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，菌體發(fā)生自溶，釋放的蛋白酶降解了部分抗菌蛋白，使其活性降低。結(jié)果顯示，菌株H15產(chǎn)抗菌肽的最適培養(yǎng)時(shí)間為48 h。本試驗(yàn)中，不同培養(yǎng)時(shí)間下，菌株H15所產(chǎn)抗菌肽的抑菌活性存在有顯著差異（P＜0.05），因而，選擇48 h作為下一步響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.2.2接種量的影響

圖3　不同接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

由圖3可知，接種量為3%時(shí)該發(fā)酵上清液的抑菌活性較高，但是方差分析結(jié)果顯示不同接種量對(duì)抗菌肽的合成影響并不顯著（P＞0.05），這可能是由于抗菌肽是細(xì)菌生長(zhǎng)到一定階段，為適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生的，它的合成是受菌體細(xì)胞群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的。雖然試驗(yàn)最開始采用了不同的接種量，但是在發(fā)酵48 h后，各處理菌體數(shù)量基本一致，抗菌肽的活性也差異不大。鑒于此，在后期的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中未選擇接種量作為考察因素。

2.2.3初始pH值的影響

圖4　不同初始pH值對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of initial pH on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

由圖4可知，發(fā)酵初始pH值對(duì)該菌株抑菌活性的影響較為顯著（P＜0.05），當(dāng)發(fā)酵初始pH值在5.0～7.0范圍內(nèi)時(shí)，菌株H15抗菌肽的抑菌活性增加，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為7.0時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大。之后，隨發(fā)酵初始pH值的繼續(xù)升高，抑菌活性呈逐漸下降趨勢(shì)。這可能是由于某些酸性或堿性條件使得抗菌肽的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程受阻。根據(jù)發(fā)酵上清液抑菌活性的測(cè)定結(jié)果，確定該菌株產(chǎn)生抗菌肽的最適初始pH值為7.0，并選擇初始pH 7.0作為下一步響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.2.4培養(yǎng)溫度的影響

由圖5可知，不同的培養(yǎng)溫度對(duì)抗菌肽的活性有較大影響（P＜0.05）。隨著溫度的升高，發(fā)酵液的抑菌活性不斷增強(qiáng)，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大（22.78 mm），然而，隨著溫度的繼續(xù)升高，發(fā)酵液的抑菌活性明顯下降。因此，確定菌株H15合成抗菌肽的最適溫度為30 ℃，并選擇其為下一步響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

圖5　不同培養(yǎng)溫度對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

2.2.5轉(zhuǎn)速的影響

圖6　不同轉(zhuǎn)速對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.6 Effect of rotational speed on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

由圖6可知，不同的轉(zhuǎn)速對(duì)抗菌肽的抑菌活性有顯著影響（P＜0.05）。隨著轉(zhuǎn)速的升高，發(fā)酵液的抑菌活性不斷增強(qiáng)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，抑菌圈直徑達(dá)到最大，然而，隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)升高，發(fā)酵液的抑菌活性下降。因此，確定菌株H15合成抗菌肽的最適轉(zhuǎn)速為160 r/min。

雖然轉(zhuǎn)速對(duì)抗菌肽的產(chǎn)生有影響，但沒有初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度這3 個(gè)因素影響大，因此后期的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中未選擇轉(zhuǎn)速作為考察因素。

2.3解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1回歸模型的建立及方差分析

采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，方案及結(jié)果見表1。用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到解淀粉芽孢桿菌H15上清液的抑菌圈直徑（Y）對(duì)培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時(shí)間（B）、初始pH值（C）的多項(xiàng)回歸方程：Y=－237.446 50+6.951 15A+1.519 52B+ 35.476 50C+2.5×10－4AB－0.070 5AC－0.026 875BC－0.105 44A2－0.013 861B2－2.393 50C2。2.3.2 回歸模型方差分析

表1　中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 1 Design and results of central composite tests

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2?；貧w模型極顯著（P=0.004 9），失擬檢驗(yàn)不顯著（P=0.397 9），說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。同時(shí)，該模型的決定系數(shù)為R2=0.968 7，說(shuō)明方程與實(shí)際的試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好，較好地反映了無(wú)菌濾液的抑菌活性與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值的關(guān)系，因此可用該模型對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15代謝產(chǎn)抗菌肽的培養(yǎng)條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)來(lái)判定，P值越小，則響應(yīng)變量的顯著程度越高。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：模型一次項(xiàng)C極顯著，A、B不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2均處于極顯著水平；交互項(xiàng)AB、AC、BC均不顯著。

表2　擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 2 Analysis of variance （ANOVA） for the fitted quadratic polynomial model odel

2.3.3響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

由回歸方程所作的響應(yīng)面立體分析圖及其等高線如圖7～9所示，它們分別反映了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值這3 個(gè)因素的兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。通過(guò)方程可知，二次項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)值，其所表征的拋物面開口向下，具有極大值點(diǎn)。利用Design Expert 8.0.6.1軟件分析，可得菌株H15的抑菌活性的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30.79 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48. 61 h、初始pH 6.68，在此條件下無(wú)菌濾液的抑菌圈直徑為25.17 mm。

圖7　培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株H15發(fā)酵液抑菌活性影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖Fig.7 Response surface and conto ur plots for the effect of fermentation temperature and fermentation time on the antifungal activity of fermented broth

圖8　初始pH值和培養(yǎng)溫度對(duì)菌株H15發(fā)酵液抑菌活性影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of initial pH and fermentation temperature on the antifungal activity of fermented broth

圖9　初始pH值和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株H15發(fā)酵液抑菌活性影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of initial pH and fermentation time on the antifungal activity of fermented broth

2.3.4回歸模型的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)值，利用優(yōu)化后確定的培養(yǎng)條件進(jìn)行3 次重復(fù)搖瓶實(shí)驗(yàn)，無(wú)菌濾液的抑菌圈直徑平均值為25.21 mm，與預(yù)測(cè)值擬合率達(dá)99.25%，表明預(yù)測(cè)值和實(shí)際值有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。優(yōu)化后抗菌肽的抑菌活性比優(yōu)化前（16.40 mm）提高了53.48%，說(shuō)明本試驗(yàn)所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計(jì)合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠明顯提高發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的活性。

2.4不同提取方法獲得抗菌肽對(duì)真菌的抑菌效果

圖10　不同提取方法獲得的抗菌肽對(duì)4 株玉米攜帶優(yōu)勢(shì)真菌的抑菌效果Fig.10 Inhibitory effects of antifungal peptides from different extraction methods on four dominant molds isolated from corn

目前解淀粉芽孢桿菌抗菌肽的提取方法主要有硫酸銨沉淀法和鹽酸沉淀有機(jī)溶劑抽提法。由圖10可知，以4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢(shì)霉菌［草酸青霉（Penicillium oxalicum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、黑曲霉（Aspergillus niger）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）］為指示菌，結(jié)果均表明，鹽酸沉淀有機(jī)溶劑抽提均要比硫酸銨沉淀法抗菌肽提取效果好，5 種有機(jī)溶劑比較，丙酮抽提效果最好，其次為乙醇，但它們之間沒有顯著性差異。

不同質(zhì)量 濃度的硫酸銨之間抑菌圈的大小差別不是很大，且抑菌效果不明顯。采用鹽酸沉淀有機(jī)溶劑抽提時(shí)，隨著pH值降低，發(fā)酵液中將出現(xiàn)大量的沉淀，當(dāng)pH值降至2.0時(shí)沉淀量達(dá)到最大，沉淀分別用甲醇、丙酮、乙醇及乙酸乙酯和正丁醇抽提。不同有機(jī)溶劑抽提效果差距明顯，其中丙酮抽提效果最好，乙酸乙酯效果最弱。綜上所述，選擇丙酮作為提取溶劑。

3　討 論

芽孢桿菌次生代謝物的產(chǎn)生主要受培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分（碳、氮源和無(wú)機(jī)鹽）、發(fā)酵條件（溫度、pH值、發(fā)酵時(shí)間、接種量、通氣量等）和高度復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的影響［10］。本研究比較了5 種常用細(xì)菌培養(yǎng)基和5 種已報(bào)道芽孢桿菌抗菌物質(zhì)發(fā)酵優(yōu)化后的培養(yǎng)基，對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同等發(fā)酵條件下，YSB和L-1培養(yǎng)基均可獲得相對(duì)較高活性的抗菌肽，顯著高于其他8 種培養(yǎng)基。但考慮到抗菌物質(zhì)的提取純化過(guò)程是一個(gè)不斷去除非活性物質(zhì)和逐漸濃縮活性物質(zhì)的過(guò)程。初始培養(yǎng)液中含有抗菌物質(zhì)的濃度越大，成分越簡(jiǎn)單清楚，越利于提高純化物的得率，簡(jiǎn)化后期的提取環(huán)節(jié)，降低生產(chǎn)成本，而且有利于純化物的鑒定和分析。YSB和L-1兩個(gè)高產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基比較，L-1培養(yǎng)基主要由谷氨酸鈉和無(wú)機(jī)鹽組成，成分相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低，后續(xù)抗菌物質(zhì)分離容易，該培養(yǎng)基具備了今后抗菌肽大量工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用的先決條件。因此，采用L-1培養(yǎng)基作為進(jìn)一步試驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

采用L-1培養(yǎng)基對(duì)解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究首先應(yīng)用單因素試驗(yàn)，對(duì)影響解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的諸多因素進(jìn)行了評(píng)價(jià)，篩選出了影響發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的主要內(nèi)在因素（培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和初始pH值）。進(jìn)一步在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)曲面法對(duì)主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，建立解淀粉芽孢桿菌H15菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的二次多項(xiàng)式回歸模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)。通過(guò)對(duì)該模型進(jìn)行求導(dǎo)和解矩陣可知，在各因素分別為培養(yǎng)時(shí)間48.61 h、培養(yǎng)溫度30.79 ℃、初始pH 6.68、轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量3%時(shí)，可獲得最高活性的抑菌物質(zhì)，預(yù)測(cè)值為25.17 mm。在此條件下再進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到發(fā)酵液抑菌圈直徑25.21 mm，與預(yù)測(cè)值擬合率達(dá)99.25%，比優(yōu)化前（16.40 mm）提高了53.48%。說(shuō)明本試驗(yàn)所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計(jì)合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠明顯提高發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于芽孢桿菌抗菌肽的研究多數(shù)集中于提高其發(fā)酵產(chǎn)量方面，而如何將高產(chǎn)量的抗菌物質(zhì)從培養(yǎng)基質(zhì)中高效提取出來(lái)鮮有報(bào)道。復(fù)雜基質(zhì)共存下微量活性物質(zhì)的高效提取仍是困擾資源高效利用的瓶頸問(wèn)題。因此，本研究選取4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢(shì)霉菌［草酸青霉（Penicillium oxalicum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、黑曲霉（Aspergillus niger）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）］為指示菌，對(duì)目前報(bào)道的適合芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的提取方法，主要有硫酸銨沉淀法和鹽酸沉淀有機(jī)溶劑法，進(jìn)行比較分析。結(jié)果均表明，鹽酸沉淀有機(jī)溶劑抽提均要比硫酸銨沉淀法抗菌肽提取效果好，5 種有機(jī)溶劑（甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯和正丁醇）比較，丙酮抽提效果最好。這些發(fā)酵和提取工藝優(yōu)化結(jié)果對(duì)將來(lái)研究利用該菌的活性物質(zhì)具有一定指導(dǎo)意義。

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Optimization of Fermentation Conditions for Production of Antifungal Peptides by Bacillus amyloliquefaciens H15 and Comparison of Extraction Methods for Antifungal Peptides

HAN Yuzhu1，2， DENG Zhao2， ZHANG Bao2， YOU Chengzhen2， CONG Yuan2， LI Pinglan2，*
（1. Department of Animal Science， Rongchang Campus， Southwest University， Chongqing 402460， China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Fermentation and extraction conditions for antifungal peptide production by Bacillus amyloliquefaciens H15 were optimized for larger diameters of inhibitory zones of Fusarium oxysporum ACCC 37438 when exposed to cell-free fermentation broths. Results showed that using L-1 medium， the optimal culture conditions were 3%， 6.68， 160 r/min，48.61 h and 30.79 ℃ for inoculum amount， initial pH， rotational speed， culture time and temperature， respectively， leading to an inhibitory zone diameter of 25.21 mm， which was 53.48% higher than that （16.40 mm） before optimization. In addition，extraction efficiencies of ammonia sulfate precipitation and hydrochloric acid precipitation followed by organic solvent extraction for the extraction of antifungal peptides from the fermentation broth were compared by using four dominant molds isolated from corn as the indicator strains. All the obtained results showed that hydrochloric acid precipitation and then acetone extraction yielded the highest antifungal activity.

antifungal peptides； Bacillus amyloliquefaciens； fermentation condition； extraction method

TQ920.6

A

1002-6630（2015）15-0135-07

10.7506/spkx1002-6630-201515025

2014-09-17

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303014）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA101609-7）；西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目（2013Bsr06）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2015C121）

韓玉竹（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槲⑸锘钚源x產(chǎn)物。E-mail：63214419@qq.com

李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn