甘 奕，李洪軍，付 楊，賀稚非*，倪冬冬

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716）

韓國泡菜加工過程中微生物區(qū)系的研究

甘 奕，李洪軍，付 楊，賀稚非*，倪冬冬

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716）

為了解韓國泡菜在制作過程中微生物的區(qū)系，分離鑒定其在腌制、發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物。結(jié)果表明：韓國泡菜腌制過程中優(yōu)勢乳酸菌經(jīng)鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；優(yōu)勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）；韓國泡菜在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）；優(yōu)勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

韓國泡菜；優(yōu)勢微生物；分離鑒定

韓國泡菜（kimchi）以新鮮蔬菜為主要原料，佐以姜、蒜、蔥、蘿卜和各種水果以及鹽、辣椒面等調(diào)味料，經(jīng)鹽腌、拌料，在低溫條件下經(jīng)微生物發(fā)酵而成，堪稱韓國“第一菜”［1］；與德國的酸甜甘藍(lán)、西歐的酸黃瓜、中國涪陵榨菜并稱世界四大醬腌菜。

韓國泡菜因其熱量低，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有維持人體腸道健康［2］、抗菌［3-4］、抗肥胖［5］、抗衰老［6］、抗腫瘤［7］等特點(diǎn)，并因旅游業(yè)的發(fā)展而受到國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。韓國每年大約消耗145 萬t泡菜，1996年韓國泡菜生產(chǎn)量為29.5 萬t，到2002年為50 萬t［8］；1999年韓國本土的泡菜市場產(chǎn)值大約是2 萬億韓元（約合16.7 億美元）［9］，至今每年銷售收入達(dá)到24 億美元以上［10］；其品種已超過190 種［11］，并由原本的家庭作坊生產(chǎn)進(jìn)入到工業(yè)化生產(chǎn)的成熟期［12］。泡菜的英文名“Kimchi”也被尼斯國際商品分類目錄收錄［13］；2008年通過俄羅斯生物醫(yī)學(xué)研究中心的不懈努力SK（太空泡菜）可以作為太空食品進(jìn)入太空，并且保質(zhì)期可以達(dá)到30 d［14］。如何高產(chǎn)、高質(zhì)量地生產(chǎn)出韓國泡菜對韓國泡菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分重要。若能參照制備酸奶發(fā)酵劑對韓國泡菜進(jìn)行直投式發(fā)酵，不僅能加快發(fā)酵速率、提高泡菜的品質(zhì)［15-16］，更能較好地推動泡菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而目前的研究主要集中于四川泡菜［17-18］，針對韓國泡菜的研究較少。

研究表明，明串珠菌類（Leuconostoc citreum）、融合乳桿菌（Weissella confusa）、沙克乳桿菌（Lactobacillus saker）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）對泡菜風(fēng)味口感有著重要的作用［19］。微生物種類隨泡菜品種的不同而不同［20］，并受地域及腌制季節(jié)影響［21］。因此，對韓國泡菜生產(chǎn)過程中菌種的分離鑒定及菌種特征等的研究具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

本實(shí)驗(yàn)以韓國泡菜為研究對象，分離鑒定其在腌制、發(fā)酵過程中的優(yōu)勢微生物，以期為提高產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

大白菜、面粉、海鹽、白蘿卜、韭菜、紅蘿卜、姜、蘋果、梨、糖，均購于重慶永輝超市；韓國辣椒粉、魚露購于韓國樂天超市。

1.2儀器與設(shè)備

FA2004分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SS-325高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 江蘇蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；MJ-160霉菌培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；B203生物顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1韓國泡菜的制作

將新鮮的整棵白菜豎切分成兩半或四等份，用海鹽均勻涂抹在每層白菜葉表面，室溫腌制8～10 h后清水清洗并將水排盡；將紅蘿卜、白蘿卜、韭菜切成細(xì)絲；蘋果、梨、姜制成泥狀；取少量面粉，煮成熟面粉；調(diào)料配制：向熟面粉里加入適量韓國辣椒面、魚露、白糖、鹽、（蘋果、梨、姜）泥，攪拌后加入蘿卜絲、韭菜絲；將配好的調(diào)料由白菜芯開始均勻地抹于每一片白菜葉，直至外層的葉子抹完；用最外層葉子將白菜包住，將辣白菜整齊地放進(jìn)容器里；放有泡菜的容器放入0～4 ℃冰箱。

1.3.2微生物區(qū)系的分離鑒定

選擇腌制第6小時、發(fā)酵第15天的泡菜樣品的計(jì)數(shù)平板分離純化進(jìn)行微生物的鑒定。

1.3.2.1劃線分離

分別從泡菜腌制階段和發(fā)酵階段的MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)平板的表面以及內(nèi)部挑取外觀形態(tài)不一樣的菌落，分別在MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基采取交叉劃線法，劃線3～4 次，直至培養(yǎng)得出純菌落。

1.3.2.2菌種保存

將分離得到的微生物純菌落接種于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基，編號、記錄，適宜環(huán)境中充分生長后，放置于4 ℃冰箱內(nèi)貯藏。

1.3.2.3菌種活化

微生物鑒定實(shí)驗(yàn)前，將貯藏于冰箱內(nèi)的菌種進(jìn)行活化。無菌操作，用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基所保藏的菌種，在相應(yīng)培養(yǎng)基上劃線分離并培養(yǎng)。

1.3.2.4微生物的鑒定

乳酸菌的鑒定方法：參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［22］。

菌落形態(tài)觀察：菌落的大小和形狀、邊緣、表面、透明度、隆起形狀、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。

細(xì)胞形態(tài)的觀察：挑取純單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并用顯微鏡油鏡觀察細(xì)胞形狀和排列方式。

生理生化特征的鑒定：主要包括生長NaCl耐受性實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、精氨酸產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、生長溫度耐受性實(shí)驗(yàn)、生長pH值耐受性實(shí)驗(yàn)、M.R.實(shí)驗(yàn)、糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、V.P.實(shí)驗(yàn)等。具體操作及培養(yǎng)基的配制均參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》。

酵母菌的鑒定方法：參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》［23］。

菌落形態(tài)觀察：菌落大小、表面形狀、凸起、邊緣、表面光澤、菌落質(zhì)地、透明度、氣味等。

細(xì)胞形態(tài)的觀察：取菌落于載玻片上，直接用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和排列方式。

生理生化特征的鑒定：主要包括碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉化合物實(shí)驗(yàn)、耐高滲透壓實(shí)驗(yàn)，觀察擲孢子、假菌絲、子囊孢子等。具體操作方法參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》。

2　結(jié)果與分析

2.1韓國泡菜中優(yōu)勢乳酸菌的分離鑒定結(jié)果

表1　韓國泡菜腌制和發(fā)酵過程中乳酸菌分離結(jié)果Table 1 Lactic acid bacteria isolated from kimchi during pickling and fermentationation

從腌制6 h韓國泡菜的各乳酸菌計(jì)數(shù)平板上總共挑取6 株形態(tài)不同的菌落，經(jīng)分離純化及形態(tài)學(xué)初步鑒定，篩選出3 株形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)各不相同的乳酸菌進(jìn)行鑒定，編號A-1、A-2、A-3；從發(fā)酵15 d韓國泡菜的各乳酸菌計(jì)數(shù)平板上總共挑取15 株形態(tài)不同的菌落，經(jīng)分離純化及形態(tài)學(xué)的初步鑒定，篩選出9 株菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)各不相同的乳酸菌進(jìn)行鑒定，分別編號為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9。乳酸菌分離結(jié)果見表1及圖1。

圖1　韓國泡菜腌制和發(fā)酵過程中乳酸菌菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)（10×1000）Fig.1 Colonial morphology and micro-morphology of lactic acid bacteria （10 × 100）

根據(jù)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》初步鑒定出：A-1、A-2、B-6、B-7、B-8為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）；A-3、B-1、B-2、B-3為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；B-4、B-5為彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）；B-9為腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）。即腌制過程中主要的細(xì)菌是短乳桿菌、植物乳桿菌；發(fā)酵過程中主要的細(xì)菌除短乳桿菌、植物乳桿菌外；還有彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）；腸膜明串珠菌腸膜亞種。這主要因?yàn)轫n國泡菜為低溫低鹽制得，以異型發(fā)酵為主，使得泡菜產(chǎn)品的酸味較淡、風(fēng)味柔和飽滿。

表2　乳酸菌的鑒定結(jié)果Table 2 Results of lactic acid bacterial identification

2.2韓國泡菜中優(yōu)勢酵母菌的分離鑒定結(jié)果

表3　韓國泡菜腌制和發(fā)酵過程中酵母菌分離結(jié)果Table 3 Yeasts isolated from kimchi during pickling and fermentation

從腌制6 h韓國泡菜的各虎紅瓊脂計(jì)數(shù)平板上總共挑取5 株形態(tài)不同的菌落，經(jīng)分離純化及形態(tài)學(xué)初步鑒定，篩選出3 株形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)各不相同的酵母進(jìn)行鑒定，編號L-1、L-2、L-3；從發(fā)酵15 d韓國泡菜的各虎紅瓊脂計(jì)數(shù)平板上總共挑取8 株形態(tài)不同的菌落，經(jīng)分離純化及形態(tài)學(xué)的初步鑒定，篩選出5 株菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)各不相同的乳酸菌進(jìn)行鑒定，分別編號為N-1、N-2、N-3、N-4、N-5。酵母菌分離結(jié)果見表3與圖2。

圖2　酵母菌菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài)（10×400）Fig.2 Colonial morphology and micro-morphology of yeasts （10 × 40）

表4　酵母菌的鑒定結(jié)果Table 4 Results of yeasts identification

根據(jù)表4碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)及其他生化反應(yīng)結(jié)果，對照《酵母菌的特征與鑒定手冊》初步鑒定出：L-1、L-2、N-1、N-2為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）；L-3、N-3、N-4為粗狀假絲酵母（Candida valida）；N-5為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。即腌制的過程中主要的酵母菌是近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）；發(fā)酵過程中除這兩種酵母外，還有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。由于韓國泡菜屬于部分需氧、部分厭氧發(fā)酵，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中主要包括乙酸等物質(zhì)［24］，因此與四川泡菜相比，韓國泡菜成熟后略帶酒精的風(fēng)味。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在韓國泡菜的不同制作階段，其優(yōu)勢微生物種類不同。在腌制過程中的優(yōu)勢乳酸菌為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；腌制過程中優(yōu)勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）。韓國泡菜在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢乳酸菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）；優(yōu)勢酵母菌為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、粗狀假絲酵母（Candida valida）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

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Microflora of Kimchi during Production

GAN Yi， LI Hongjun， FU Yang， HE Zhifei*， NI Dongdong
（Special Food Engineering and Technology Research Center of Chongqing， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400716， China）

In order to explore the microflora of kimchi during the production process， the predominant microorganisms were isolated and identified. The results showed that during the pickling process of kimchi， the dominant lactic acid bacteria were Lactobacillus brevis and Lactobacillus plantarum； the dominant yeasts were Candida parapsilosis and Candida valida. The dominant lactic acid bacteria in kimchi during fermentation were Lactobacillus plantarum， Lactobacillus curvatus，Lactobacillus brevis and Lactobacillus mesenteroides subsp. mesenteroides； the dominant yeasts during fermentation were Candida parapsilosis， Candida valida， and Saccharomyces cerevisiae.

kimchi； dominant microorganisms； isolation and identification

TS255.54

A

1002-6630（2015）15-0118-05

10.7506/spkx1002-6630-201515022

2014-09-19

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（200903012）

甘奕（1989—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全控制。E-mail：Lizzie_ganyi@hotmail.com

賀稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：2628576386@qq.com