李曉明，孔陽(yáng)輝，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

糖基化對(duì)β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)的影響

李曉明，孔陽(yáng)輝，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

目的：考察還原糖以及活性二羰基化合物誘導(dǎo)的β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-lg）發(fā)生糖基化后結(jié)構(gòu)的變化。方法：運(yùn)用氣相色譜法檢測(cè)β-乳球蛋白+乳糖糖基化反應(yīng)體系中二羰基化合物的產(chǎn)生，并通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法、圓二色譜法、體積排阻色譜法定性分析不同活性羰基引發(fā)糖基化反應(yīng)對(duì)β-lg結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：β-乳球蛋白+乳糖糖基化反應(yīng)體系可以迅速產(chǎn)生二羰基化合物，在125 ℃條件下，30 min后，丙酮醛和乙二醛含量高達(dá)207 μg/g和180 μg/g，而后逐漸減少并趨于穩(wěn)定（150 μg/g）。光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，還原糖以及活性二羰基化合物可以有效地誘導(dǎo)β-lg結(jié)構(gòu)從β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋；通過(guò)體積排阻色譜實(shí)驗(yàn)，β-lg加熱糖基化后在120～190 min有新的產(chǎn)物色譜峰產(chǎn)生。結(jié)論：還原糖和活性二羰基化合物能有效地誘導(dǎo)β-lg糖基化反應(yīng)，引起其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。

β-乳球蛋白；圓二色譜；二羰基化合物；結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)在糖以及活性二羰基化合物的作用下，蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基的游離氨基與活性羰基作用引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能改變的反應(yīng)［1］。其中活性二羰基化合物（丙酮醛（methylglyoxal，MGO）和乙二醛（glyoxal，GO））是形成晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的前體物質(zhì)，具有高反應(yīng)活 性，比葡萄糖的活性高200～50 000 倍［2］。蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)會(huì)形成分子內(nèi)或者分子間交聯(lián)，最終產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的AGEs［3］。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-lg）是反芻動(dòng)物乳中的主要乳清蛋白成分，天然β-lg以二聚體形式存在［4］。β-lg常作為輔助性配料用于乳制品、焙烤食品以及運(yùn)動(dòng)飲料等食品中。在食品的加工及貯藏過(guò)程中，β-lg易與還原糖發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)。糖基化雖然能改善乳球蛋白的乳化性、抗氧化性［5］以及降低致敏性［6-7］，但是，在β-lg糖基化的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列對(duì)人體有害的AGEs［8］。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)糖基化還能引起β-lg分子結(jié)構(gòu)的改變［9］。Fenaille等［9］利用電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸附電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS）確定了β-lg與乳糖（lactose，Lac）或半乳糖的糖基化位點(diǎn)。糖基化可能會(huì)導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，通過(guò)圓二色譜［10］技術(shù)可以考察α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的增減。Chevalier等［11］對(duì)β-lg與不同還原糖在60 ℃條件下反應(yīng)72 h后進(jìn)行圓二色譜掃描，發(fā)現(xiàn)其在近紫外和遠(yuǎn)紫外區(qū)都有明顯變化。蛋白質(zhì)糖基化會(huì)引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)，從而使其分子質(zhì)量增大。目前，常用的檢測(cè)蛋白質(zhì)糖基化分子質(zhì)量變化的手段有凝膠排阻色譜和聚丙烯酰胺凝膠變性電泳分析［12-13］。Chevalier等［11］發(fā)現(xiàn)β-lg與多種糖類糖基化反應(yīng)后蛋白分子質(zhì)量增加，小部分糖基化β-lg因發(fā)生交聯(lián)，分子質(zhì)量增大而保留在濃縮膠中，并且糖基化蛋白分子質(zhì)量呈現(xiàn)高度的異質(zhì)性。Gu Fenglin等［14］使用凝膠Sephadex G-75分離酪蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物，在220、280、420 nm波長(zhǎng)處都監(jiān)測(cè)到了2 個(gè)吸收峰。目前，其他研究學(xué)者也通過(guò)凝膠排阻色譜法分析檢測(cè)乳球蛋白質(zhì)糖基化后產(chǎn)物的變化情況［15-18］，結(jié)果表明，在280 nm波長(zhǎng)處均有新的吸收峰產(chǎn)生。

還原糖中碳原子的數(shù)目也會(huì)影響蛋白質(zhì)糖基化的程度和速度。Chevalier等［11］證實(shí)β-lg與核糖（ribose，Rib）反應(yīng)糖基化程度最大，達(dá)到69.4%，而其他糖類與β-lg糖基化程度由大到小依次是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、乳糖。Jing Hao等［19］發(fā)現(xiàn)五碳糖比六碳糖更易和蛋白質(zhì)產(chǎn)生AGEs，且單糖比雙糖也更易反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立乳球蛋白-還原糖體系以及乳球蛋白-二羰基化合物體系，對(duì)比考察還原糖以及糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物二羰基化合物對(duì)β-lg結(jié)構(gòu)的改變。首先運(yùn)用氣相色譜檢測(cè)β-乳球蛋白+乳糖（β-lg+Lac）糖基化反應(yīng)體系中二羰基化合物的產(chǎn)生，并通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法、圓二色譜法、體積排阻色譜法定性分析糖基化對(duì)β-lg結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而為其功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

β-lg（純度≥92%，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量18.4 kD） 南京師范大學(xué)隨園校區(qū)金陵女子學(xué)院605實(shí)驗(yàn)室自制；2，3-丁二酮 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷 南京化學(xué)試劑有限公司；衍生化試劑鄰苯二胺、MGO（40%質(zhì)量分?jǐn)?shù)水溶液）、GO（40%質(zhì)量分?jǐn)?shù)水溶液）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；丙烯酰胺、N-N'-甲叉雙丙烯酰胺、N，N，N，N-四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、三羥基氨基甲烷、溴酚藍(lán)、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、核糖、乳糖生工生物工程（上海）股份有限公司；β-巰基乙醇、冰醋酸 南京賽吉科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

7820氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技公司；KQ-300B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HGC-12A氮?dú)獯蹈蓛x 天津恒奧科技發(fā)展有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DYCZ-24D型夾芯式垂直電泳槽、JY600C型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀 北京市六一儀器廠；UV-61000紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Chirascan圓二色光譜儀 英國(guó)應(yīng)用光物理公司。

1.3方法

1.3.1氣相色譜法測(cè)定β-lg糖基化中間產(chǎn)物MGO和GO

1.3.1.1β-l g+Lac模擬體系的制備

用0.05 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解β-lg，在10 mL的離心管中加入3.5 mg/mL β-lg稀釋液3 mL，再加入0.05 mmol/L pH 7.4的PBS稀釋后的乳糖溶液（49.7 mg/mL）4 mL，使其與乳球蛋白的濃度比為1 000∶1，體系最終體積為7 mL。置于高壓滅菌鍋中，在125 ℃條件下反應(yīng)0、15、30、45、60 min后，迅速置于冰浴中冷卻，14 000×g離心5 min，取上清液為待測(cè)試樣?？瞻捉M以PBS代替乳糖溶液，做3 組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.2樣品中二羰基化合物的衍生化

依據(jù)文獻(xiàn)［20］的測(cè)定方法，并加以改進(jìn)，即在10 mL樣品管中分別加入上一步生成的β-lg糖基化待測(cè)試樣2 mL，各加1 mL 100 mmol/L的鄰苯二胺，0.5 mL 1 mmol/L的2，3-丁二酮（內(nèi)標(biāo)）配制液，混勻，60 ℃水浴加熱15 min，冰浴冷卻5 min后在室溫條件下加1 mL 2 mol/L的乙醛，混 勻，60 ℃水浴加熱15 min，冰浴5 min后在室溫條件下加2 mL二氯甲烷，超聲波萃取15 min，重復(fù)萃取3 次。下層二氯甲烷相氮?dú)獯蹈桑?.5 mL二氯甲烷復(fù)溶，取1 μL進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。

1.3.1.3氣相色譜檢測(cè)條件

依據(jù)文獻(xiàn)［20］的測(cè)定方法，并加以改進(jìn)。色譜柱：HP-5色譜柱（30 m× 0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣溫度：250 ℃；壓力：10 p si；分流比：1∶1；色譜柱升溫方式：初始值40 ℃，保持1 min，以4 ℃/min程序升溫，升至140 ℃，保持1 min；以50 ℃/min升至250 ℃，保持1 min，總運(yùn)行時(shí)間30.2 min；氫火焰離子檢測(cè)器溫度：280 ℃；H2流量：30 mL/mi n；空氣流量：300 mL/min；N2流量：25 mL/min；上樣量：1 μL。

2 mL不同濃度的MGO和GO標(biāo)準(zhǔn)品取代待測(cè)試樣如上述條件進(jìn)行衍生化，氣相色譜測(cè)定其含量，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.1.4二羰基化合物含量的計(jì)算

以丁二酮為內(nèi)標(biāo)物，二羰基化合物喹喔啉衍生物主要的摩爾吸光系數(shù)來(lái)源于喹喔啉端，計(jì)算二羰基化合物喹喔啉衍生物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比，并以峰面積之比（y）對(duì)二羰基化合物含量（x）進(jìn)行線性回歸。

1.3.2β-lg糖基化反應(yīng)對(duì)體系pH值的影響

將適量β-lg溶于蒸餾水中，在10 mL具塞試管中分別加入乳糖、核糖、MGO、GO，使得β-lg最終質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，β-lg與糖的物質(zhì)的量比為1∶1 000，MGO、GO的最終濃度為1.5 mmol/L。參考文獻(xiàn)［21］的方法，用1 mol/L的NaOH將體系初始pH值調(diào)為8.5，95 ℃水浴加熱。在反應(yīng)0、0.5、1、2、3、4 h后分別取樣，置于冰水中冷卻，然后在室溫測(cè)量體系的pH值?？瞻捉M只加入β-lg，每個(gè)反應(yīng)做3 組平行。

1.3.3糖基化對(duì)β-lg結(jié)構(gòu)的影響

1.3.3.1β-lg+Lac模擬體系的制備

用濃度為0.05 mmol/L，pH 7.4的PBS溶解β-lg，在10 mL具塞試管中分別加入乳糖、核糖、MGO、GO，使得β-lg最終質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，β-lg與糖的物質(zhì)的量之比為1∶1 000，MGO、GO的最終濃度為1.5 mmol/L。60 ℃水浴加熱，在反應(yīng)0、4、8、16、24、48 h處各取1 mL，置于冰水中冷卻至室溫。

1.3.3.2紫外光譜分析

取上述反應(yīng)液，用蒸餾水稀釋4 倍，利用紫外分光光度計(jì)在200～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)量其吸光度?？瞻捉M只加入β-lg，每組反應(yīng)做3 個(gè)平行。

1.3.3.3圓二色譜分析

取上述反應(yīng)液，用蒸餾水稀釋3 倍。選用光徑為1 mm的比色皿，用圓二色光譜儀分別在200～250 nm波段（遠(yuǎn)紫外區(qū)）和250～300 nm波段（近紫外區(qū)）進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.3.4凝膠色譜柱分析β-lg糖基化產(chǎn)物

用0.05 mmol/L pH 7.4的PBS溶解β-lg，在10 mL的離心管中加入3.5 mg/mL β-lg稀釋液3 mL，再加入PBS稀釋后的乳糖溶液4 mL，使其與β-lg的濃度比為1 000∶1，體系最終體積為7 mL。反應(yīng)試樣95 ℃水浴加熱，在0、30、60、120、180、240 min時(shí)分別取樣1 mL，冰浴冷卻，置于4 ℃保存。Sephadex G-75層析柱（1.0 cm×80 cm）裝柱，0.8 mL/min蒸餾水平衡12 h。將0.1 mL待測(cè)試樣加于層析柱界面，0.8 mL/min的蒸餾水進(jìn)行洗脫，280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸收峰。

2　結(jié)果與分析

2.1β-lg糖基化中間產(chǎn)物MGO和GO的產(chǎn)生

依據(jù)1.3.1.4節(jié)中MGO和GO標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：MGO：y = 0.362 1x－0.441 5（R2= 0.996 1）；GO：y = 0.371x－0.427 2（R2=0.997 1）。其中，y為二羰基化合物喹喔啉衍生物與內(nèi)標(biāo)喹喔啉衍生物氣相色譜峰面積之比，x為二羰基化合物含量。

圖1　二羰基化合物的含量隨時(shí)間的變化（125 ℃，pH 7.5）Fig.1 Effect of reaction time （at 125 ℃ and pH 7.5） on dicarbonyl compounds content

由圖1可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)程度加強(qiáng)，形成MGO和GO。在0～30 min內(nèi)，MGO和GO形成的量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)增加，增長(zhǎng)趨勢(shì)非常顯著。30 min時(shí)，MGO和GO產(chǎn)生量均達(dá)到最高，分別為207 μg/g和180 μg/g。在30～60 min時(shí)，二羰基化合物產(chǎn)生的量開(kāi)始下降，且維持在150 μg/g左右。MGO和GO兩者相比，相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)MGO產(chǎn)生的量均高于GO。結(jié)果表明，β-lg糖基化過(guò)程中可以產(chǎn)生大量的二羰基化合物（MGO和GO），進(jìn)一步證實(shí)了二羰基化合物作為糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物，能有效的誘導(dǎo)β-lg糖基化，為后續(xù)研究還原糖以及二羰基化合物對(duì)β-lg糖基化作用效果提供了依據(jù)。

2.2β-lg糖基化反應(yīng)對(duì)體系pH值的影響

圖2　2β-lg糖基化反應(yīng)對(duì)體系pHH值的影響Fig.2 Influnece of β-lg glycation reaction on pH

β-lg糖基化反應(yīng)體系的pH值變化情況如圖2所示。隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，各體系的pH值均呈下降趨勢(shì)。下降程度與空白組相比均具有顯著差異（P＜0.05）。在0～60 min內(nèi)，各體系pH值下降速率較快，120 min后，除β-lg+Rib體系pH值下降速率繼續(xù)增加外，其余3 個(gè)體系的pH值下降趨于平衡，且相互之間沒(méi)有明顯差異。在240 min時(shí)，β-lg+Rib體系pH值由8.5降低到7.0。Jiang Zhanmei等［21］研究發(fā)現(xiàn)，糖基化中期形成的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸是導(dǎo)致糖基化體系pH值的下降的原因。

2.3紫外光譜分析糖基化對(duì)β-lg結(jié)構(gòu)的影響

圖3　60 ℃反應(yīng)體系紫外光譜隨時(shí)間的變化（0、4、8、16、24、48 h）Fig.3 Ultraviolet spectra of glycated β-lg at different reaction times（0， 4， 8， 16， 24 and 48 h） at 60 ℃

如圖3所示，60 ℃條件下反應(yīng)48 h，各β-lg糖基化體系中β-lg在250～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度隨著反應(yīng)進(jìn)程推進(jìn)而不斷增加，且各個(gè)體系中不同反應(yīng)時(shí)間下的吸光度均存在極顯著差異（P＜0.000 1）。表明在各底物作用下，β-lg結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。β-lg在280 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，這主要是由蛋白質(zhì)中的酪氨酸的酚基和色氨酸的吲哚環(huán)共同作用所引起的［22］。因此糖基化反應(yīng)后β-lg在280 nm 波長(zhǎng)處的吸光度增加，推測(cè)為各底物與β-lg中的酪氨酸［23］和色氨酸［24］發(fā)生了反應(yīng)。由圖3b可知，β-lg+Rib體系吸光度增加程度最大，280 nm波長(zhǎng)處反應(yīng)4 h，體系的吸光度已是初始的2.33 倍，48 h后達(dá)到11.33 倍；由圖3a、3c可知，β-lg+Lac和β-lg+MGO體系的吸光度雖增加程度小，但是變化也較為明顯，β-lg+Lac體系在280 nm波長(zhǎng)處反應(yīng)8 h的吸光度是初始的1.26 倍，48 h達(dá)到1.66 倍；β-lg+GO的吸光度變化最?。▓D3d）。

2.4圓二色譜分析糖基化對(duì)β-lg結(jié)構(gòu)的影響

圖4　60 ℃β-lg+Lac體系的圓二色譜變化Fig.4 Circular dichroismin spectra of glycated β-lg at different reaction times at 60 ℃

60 ℃條件下，48 h內(nèi)觀測(cè)β-lg+Lac體系圓二色譜隨反應(yīng)時(shí)間的變化，結(jié)果如圖4所示。200～250 nm遠(yuǎn)紫外區(qū)吸收信號(hào)來(lái)源于肽鍵，可表征蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；250～300 nm近紫外區(qū)吸收則是由于芳香族氨基酸（如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），反映氨基酸側(cè)鏈及二硫鍵的特征。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征不同，所產(chǎn)生的圓二色譜帶位置、吸收強(qiáng)度也不相同，因此，根據(jù)所測(cè)得蛋白質(zhì)的圓二色譜能反映出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息［5］。從圖中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的變化，圓二色譜帶呈規(guī)律性變化，說(shuō)明隨著反應(yīng)進(jìn)程的遞進(jìn)，糖基化逐漸改變?chǔ)?lg的二級(jí)結(jié)構(gòu)。β-lg+Lac反應(yīng)體系在遠(yuǎn)紫外區(qū)的吸收強(qiáng)度明顯高于β-lg，有非常明顯的負(fù)峰，并且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)負(fù)峰增大，表明糖基化反應(yīng)不斷改變著β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

表1　不同反應(yīng)底物對(duì)-lg二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Secondary structures of reaction products of β-lg with different substrates

60 ℃條件下，48 h后觀測(cè)β-lg糖基化后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如表1所示。3 個(gè)反應(yīng)體系中的β-lg二級(jí)結(jié)構(gòu)都有了明顯變化：β-折疊結(jié)構(gòu)降低，α-螺旋結(jié)構(gòu)增加表明糖基化使得β-lg β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為α-螺旋結(jié)構(gòu)。另外，無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)均有一定程度的降低。乳糖和二羰基化合物中，MGO誘導(dǎo)β-lg二級(jí)結(jié)構(gòu)變化程度最為明顯，α-螺旋結(jié)構(gòu)增加9%，β-折疊結(jié)構(gòu)減少6.5%。β-lg糖基化后糖基化后二級(jí)結(jié)構(gòu)由β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為α-螺旋結(jié)構(gòu)，與Chevalier等［11］報(bào)道相符合。Chevalier等［11］對(duì)β-lg與不同還原糖60 ℃條件下反應(yīng)72 h后進(jìn)行圓二色譜掃描，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)由β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為α-螺旋結(jié)構(gòu)，這可能會(huì)引起蛋白質(zhì)功能的改變。

2.5體積排阻色譜分析糖基化對(duì)β-lg的影響

采用體積排阻色譜監(jiān)測(cè)280 nm波長(zhǎng)處β-lg與乳糖糖基化反應(yīng)前后的變化，結(jié)果如圖5所示。β-lg純品在48～72 min左右出峰，最大吸收峰值為0.14。β-lg與乳糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后，相同上樣量的蛋白質(zhì)吸光度增加，并與糖基化時(shí)間成正相關(guān)性，反應(yīng)時(shí)間為30～240 min的糖基化反應(yīng)體系在48～72 min左右最大吸光度分別為0.21、0.27、0.32、0.66、0.93，推測(cè)其為糖基化產(chǎn)物1。糖基化反應(yīng)60 min后，洗脫時(shí)間120～190 min之間出現(xiàn)一個(gè)吸收峰，推測(cè)為糖基化產(chǎn)物2，具體是何種物質(zhì)，還有待進(jìn)一步的鑒定分析。

3　結(jié) 論

通過(guò)對(duì)β-lg+Lac體系的研究，表明在生理?xiàng)l件下，β-lg與乳糖發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)產(chǎn)生二羰基化合物，且產(chǎn)生MGO的能力較GO更強(qiáng)。MGO、GO含量在30 min時(shí)達(dá)到最高值，分別為207 μg/g和180 μg/g，而后平衡在150 μg/g左右。因此研究由活性二羰基化合物（MGO和GO）引起的蛋白質(zhì)糖基化意義重大。

β-lg與不同底物糖基化反應(yīng)時(shí)，體系的pH值會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。核糖體系pH值下降最為明顯，由初始8.5下降至7.0。引起β-lg糖基化過(guò)程中pH值下降程度：核糖＞MGO≈乳糖＞GO，GO引起蛋白質(zhì)糖基化后pH值變化的能力與核糖和MGO相比并不顯著，4 h后下降0.1。

通過(guò)對(duì)β-lg+Lac、β-lg+MGO以及β-lg+GO體系的紫外光譜和圓二色譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)?zāi)M的生理?xiàng)l件下，β-lg糖基化后，280 nm波長(zhǎng)處吸光度會(huì)隨糖基化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋增加，β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲減少。通過(guò)比較乳糖、MGO、GO可以發(fā)現(xiàn)，MGO對(duì)蛋白質(zhì)糖基化的作用最強(qiáng)，引起二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的能力：MGO＞乳糖＞GO。反應(yīng)48 h，MGO誘導(dǎo)β-lg二級(jí)結(jié)構(gòu)變化程度最為明顯，α-螺旋結(jié)構(gòu)增加9%，β-折疊結(jié)構(gòu)減少6.5%。

糖基化蛋白經(jīng)Sephadex G-75體積排阻色譜檢測(cè)，結(jié)果顯示隨糖基化反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，48～72 min左右的峰值增加，120～190 min之間出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，推測(cè)對(duì)應(yīng)兩個(gè)組分均為糖基化產(chǎn)物。

［1］ ZHANG Qibin， JENIFER M A， RICHARD D S， et al. A perspective on the Maillard reaction and the analysis of protein glycation by mass spectrometry： probing the pathogenesis of chronic disease［J］. Journal of Proteome Research， 2009， 8（2）： 754-769.

［2］ RABBANI N， THORNALLEY P J. Dicarbonyls linked to damage in the powerhouse： glycation of mitochondrial proteins and oxidative stress［J］. Biochemical Society Transactions， 2008， 36（5）： 1045-1050.

［3］ 楊秀穎， 杜冠華. 糖基化終末產(chǎn)物及相關(guān)藥物研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 2011， 27（9）： 1185-1188.

［4］ KIM J S， LEE Y S. Study of Maillard reaction products derived from aqueous model systems with different peptide chain lengths［J］. Food Chemistry， 2009， 116（4）： 846-853.

［5］ CHEVALIER F， CHOBERT J M， POPINEAU Y， et al. Improvement of functional properties of β-lactoglobulin glycated through the Maillard reaction is related to the nature of the sugar［J］. International Dairy Journal， 2001， 11（3）： 145-152.

［6］ MELTRETTER J， SEEBER S， HUMENY A， et al. Site specific formation of Maillard， oxidation， and condensation products from whey proteins during reaction with lactose［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（15）： 6096-6103.

［7］ HATTORI M， NAGASAWA K， OHGATA K， et al. Reduced immunogenicity of β-lactoglobulin by conjugation with carboxymethyl dextran［J］. Bioconjugate Chemistry， 2000， 11（1）： 84-93.

［8］ TIMO M B， HELIA L， ESTELLE L， et al. Glycolaldehyde-modified β-lactoglobulin AGEs are unable to stimulate inflammatory signaling pathways in RAGE-expressing human cell lines［J］. Molecular Nutrition and Food Research， 2011， 55（2）： 291-299.

［9］ FENAILLE F， MORGAN F， PARISOD V， et al. Solid-state glycation of β-lactoglobulin by lactose and galactose： localization of the modified amino acids using mass spectrometric techniques［J］. Journal of Mass Spectrometry， 2004， 39（1）： 16-28.

［10］ STANIC-VUCINIC D， PRODIC I， APOSTOLOVIC D， et al. Structure and antioxidant activity of β-lactoglobulin-glycoconjugates obtained by high-intensity-ultrasound-induced Maillard reaction in aqueous model systems under neutral conditions［J］. Food Chemistry，2013， 138（1）： 590-599.

［11］ CHEVALIER F， CHOBERT J M， DALGALARRONDO M， et al. Maillard glycation of β-lactoglobulin induces conformation changes［J］. Nahrung-Food， 2002， 46（2）： 58-63.

［12］ LIU Jianhua， RU Qiaomei， DING Yuting. Glycation a promising method for food protein modification： physicochemical properties and structure， a review［J］. Food Research International， 2012， 49（1）： 170-183.

［13］ CHEN Yingjia， LIANG Li， LIU Xiaoming， et al. Effect of fructose and glucose on glycation of β-lactoglobulin in an intermediatemoisture food model system： analysis by liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS） and data-independent acquisition LC-MS （LCMSE）［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2012， 60（42）：10674-10682.

［14］ GU Fenglin， KIM J M， ABBAS S， et al. Structure and antioxidant activity of high molecular weight Maillard reaction products from casein-glucose［J］. Food Chemistry， 2010， 120（2）： 505-511.

［15］ JIMENEZ-CASTANO L， LOPEZ-FANDINO R， OLANO A， et al. Study on β-lactoglobulin glycosylation with dextran： effect on solubility and heat stability［J］. Food Chemistry， 2005， 93（4）： 689-695.［16］ WOOSTER T J， AUGUSTIN M A. The emulsion flocculation stability of protein： carbohydrate diblock copolymers［J］. Journal of Colloid and Interface Science， 2007， 313（2）： 665-675.

［17］ MORGAN F， LEONIL J， MOLLE D， et al. Modification of bovine β-lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution： effect on association behavior and protein conformation［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1999， 47（1）： 83-91.［18］ WOOSTER T J， AUGUSTIN M A. β-Lactoglobulin-dextran Maillard conjugates： their effect on interfacial thickness and emulsion stability［J］. Journal of Colloid and Interface Science， 2006， 303（2）：564-572.

［19］ JING Hao， KITTS D D. Chemical and biochemical properties of casein-sugar Maillard reaction products［J］. Food and Chemical Toxicology， 2002， 40（7）： 1007-1015.

［20］ TAN Di， WANG Yu， LO C Y， et al. Methylglyoxal： its presence in beverages and potential scavengers［J］. Annals of the New York Academy of Sciences， 2008， 1126， 72-75.

［21］ JIANG Zhanmei， BRODKORB A. Structure and antioxidant activity of Maillard reaction products from α-lactalbumin and β-lactoglobulin with ribose in an aqueous model system［J］. Food Chemistry， 2012，133（3）： 960-968.

［22］ 吳序櫟， 朱倩倩， 成小娟， 等. 牛乳β-乳球蛋白熱穩(wěn)定與免疫原性關(guān)系的光譜學(xué)研究［J］. 光譜學(xué)與光譜分析， 2011， 31（8）： 2205-2209.

［23］ COUSSONS P J， JACOBY J， MCKAY A， et al. Glucose modification of human serum albumin： a structural study［J］. Free Radical Biology and Medicine， 1997， 22（7）： 1217-1227.

［24］ FUENTEALBA D， GALVEZ M， ALARCON E， et al. Photosensitizing activity of advanced glycation endproducts on tryptophan， glucose 6-phosphate dehydrogenase， human serum albumin and ascorbic acid evaluated at low oxygen pressure［J］. Photochemistry and Photobiology， 2007， 83（3）： 563-569.

Effect of Glycation on Structural Properties of β-Lactoglobulin

LI Xiaoming， KONG Yanghui， Lü Lishuang*
（Ginling College， Nanjing Normal University， Nanjing 210097， China）

Purposes： To study the structural changes of β-lactoglobulin （β-lg） after glycation induced by reducing sugar or dicarbonyl compounds. Methods： The content of dicarbonyl compounds produced from β-lg and lactose was determined by gas chromatography. The structural changes of β-lg caused by glycation initiated by different active carbonyl groups were evaluated by ultraviolet （UV）-visible spectrophotometry， circular dichroism and size exclusion chromatography. Results：Dicarbonyl compounds were produced by β-lg glycation. The contents of methylglyoxal and glyoxalall reached the highest levels at 207 μg/g and 180 μg/g respectively after heating for 30 minutes. Then， the quantity of dicarbonyl compounds began to decline， and remained at approximately 150 μg/g. The UV-visible and circular dichroism spectra showed effective transformation of β-sheet to α-helix induced by glycation. By Sephadex G-75 sizeexclusion chromatography， a new absorption peak was detected between 120 and 190 min， indicati ng the occurrence of β-lg glycation. Conclusion： Reducing sugar and dicarbonyl compounds have a very strong role in β-lg glycation reaction and consequently may change the structure of β-lg significantly.

β-lactoglobulin； circular dichroism； dicarbonyl compounds； structure

TS201.2

A

1002-6630（2015）15-0075-06

10.7506/spkx1002-6630-201515015

2014-09-22

2012年度江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）項(xiàng)目（BK2012850）

李曉明（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：lixiaoming2000@163.com

呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄允称返姆蛛x及活性。E-mail：lishuanglv@yahoo.com.cn