劉超，張曜武

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

不同方法制備的黨參復(fù)方多糖的抗氧化活性研究

劉超，張曜武

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

目的：對(duì)不同方法制備的黨參復(fù)方多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究，并對(duì)多糖純化程度與其活性的相關(guān)性進(jìn)行探索。方法：采用膜分離工藝制備黨參復(fù)方總多糖，并對(duì)得到的總多糖進(jìn)行脫蛋白、脫色等不同方法的純化，測(cè)定各多糖產(chǎn)物的還原能力、清除羥基自由基、DPPH·自由基及超氧陰離子自由基的能力。結(jié)果：不同方法制備的三種黨參復(fù)方多糖樣品均呈現(xiàn)體外抗氧化活性，并且具有良好的量效關(guān)系；總多糖經(jīng)脫蛋白、脫色等純化步驟后體外抗氧化活性減弱。結(jié)論：該黨參復(fù)方總多糖具有較好的體外抗氧化活性，制備活性多糖時(shí)，不應(yīng)盲目脫蛋白、脫色。

黨參復(fù)方；多糖；純化；抗氧化；自由基

多糖在自然界中廣泛存在，是構(gòu)成生命的基本生物大分子之一。近年來(lái)，從天然產(chǎn)物中提取得到的多糖在生物活性方面引起關(guān)注［1］。現(xiàn)有研究表明，多糖在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鸬街匾饔?，具有增?qiáng)免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性［2～4］。除上述之外，現(xiàn)有研究還發(fā)現(xiàn)許多植物多糖對(duì)各種活性氧具有清除作用，表現(xiàn)出多途經(jīng)的抗氧化活性，有關(guān)植物多糖抗氧化作用的研究目前多側(cè)重于單一藥材的多糖成分［5，6］，對(duì)中藥復(fù)方多糖成分抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道［7］。

黨參是中醫(yī)臨床常用的滋補(bǔ)藥材，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黨參具有抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性［8，9］，黨參與其它中藥配伍組成復(fù)方使用要比單味黨參藥材的應(yīng)用在中醫(yī)臨床中更為多見。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黨參復(fù)方多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究，并對(duì)黨參復(fù)方多糖的純化程度與其活性的關(guān)系進(jìn)行探討，對(duì)不同純化步驟制備的三種黨參復(fù)方多糖樣品的還原能力、清除·OH自由基、DPPH·自由基和·自由基能力進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)總多糖經(jīng)脫蛋白、脫色等純化前后的活性差異進(jìn)行比較，在確認(rèn)本實(shí)驗(yàn)所用的黨參復(fù)方多糖是否具有抗氧化活性的同時(shí)，對(duì)多糖純化程度與其活性的相關(guān)性進(jìn)一步積累規(guī)律性認(rèn)識(shí)，并為中藥復(fù)方多糖的活性研究提供參考依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、乙醇（95%）、三氯乙酸、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、三氯化鐵、DPPH、鄰苯三酚、抗壞血酸等均為分析純。

UV-1000紫外分光光度儀（北京萊伯泰科儀器有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀（上海亞榮生物儀器廠）；FA1004N分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；中空纖維膜組件（天津膜天膜科技股份有限公司）；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TDL-802B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科技儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2黨參復(fù)方多糖的制備

取黨參、黃精、三七等藥材粉碎，加水煎煮，煎液濃縮、過(guò)濾，所得濾液進(jìn)行活性炭吸附、微濾等處理后，再用截留相對(duì)分子質(zhì)量為6kDa的超濾膜分離，滲出液經(jīng)濃縮、醇沉、干燥得膜分離工藝總多糖。此后采用木瓜蛋白酶結(jié)合Sevage法脫蛋白，脫蛋白后的樣品液經(jīng)醇沉、干燥得脫蛋白多糖。再經(jīng)D101大孔樹脂吸附脫色，靜態(tài)吸附4h，抽濾，濾液醇沉、干燥得脫蛋白脫色多糖。

1.3抗氧化活性

1.3.1還原能力測(cè)定

精密量取1mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品液，加入2.5mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH7.4），2.5mL鐵氰化鉀溶液（1.0%），混合均勻后置于50℃恒溫水浴中保溫20min，取出，迅速冷卻，加入2.5mL三氯乙酸溶液（10%），混合均勻，于3000r/min離心10min，吸取上清液2.5mL于另一試管中，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL三氯化鐵溶液（0.1%），混勻后靜置10min，于700 nm處測(cè)定吸光度，吸光度值越大，表明其還原能力越強(qiáng)。以抗壞血酸Vc為對(duì)照。

1.3.2清除羥基自由基能力測(cè)定

反應(yīng)體系中依次加入9×10-3mol/LFeSO4溶液1mL，9×10-3mol/L水楊酸-乙醇溶液1mL，及1mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品液，最后加6×10-3mol/LH2O21mL，啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴中反應(yīng)0.5 h，在510nm下測(cè)定各樣品的吸光度，空白組以相同體積蒸餾水代替樣品溶液。以Vc作對(duì)照，按下式計(jì)算樣品對(duì)·OH的清除率：

·OH清除率（%）=［A0-（AX-AX0）］/A0×100%

式中：A0：為空白對(duì)照液的吸光度；

AX：為加入紅松松子殼多糖樣品液后的吸光度；AX0：為不加H2O2時(shí)紅松松子殼多糖溶液的本底吸光度。

1.3.3清除DPPH·能力測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度的多糖待測(cè)液2mL，分別加入1×10-4mol/L的DPPH·溶液2mL，搖勻，室溫避光靜置30min，以蒸餾水代替樣品液為空白，在517nm處測(cè)定吸光度。以Vc為對(duì)照，按下式計(jì)算各個(gè)樣品對(duì)DPPH·自由基的清除率（%）：

DPPH·自由基清除率（%）=［A0-（Ai-Aj）/A0］×100%

式中：A0：蒸餾水加DPPH·溶液的吸光值；

Ai：多糖樣品液加DPPH·溶液的吸光值；

Aj：多糖樣品液的本底吸光值。

1.3.4清除超氧陰離子自由基能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法，取5mL濃度為0.05mol/L的Tris-HC1緩沖液（pH=8.2）于試管中，分別加入4mL不同質(zhì)量濃度的樣品液，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，再加1mL3mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻，25℃水浴反應(yīng)4min，迅速加入1mL10mol/L的HCL終止反應(yīng)，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以Vc為對(duì)照。按下式計(jì)算清除率：

式中：A0：為空白對(duì)照液的吸光度；

AX：為加入鄰苯三酚樣品液的吸光度；

AX0：為不加鄰苯三酚樣品液的本底吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1還原能力

一般情況下，還原能力可以間接反映抗氧化能力，黨參復(fù)方多糖樣品及Vc的還原能力測(cè)定結(jié)果見圖1。由該圖可知，黨參復(fù)方多糖各樣品均表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力，其中總多糖的還原能力最強(qiáng)，脫蛋白多糖和脫蛋白脫色多糖的還原能力依次減弱，各多糖樣品的活性均弱于Vc。在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，多糖濃度與其還原能力呈正相關(guān)。

圖1　樣品和Vc的還原能力

2.2對(duì)·OH的清除作用

各樣品對(duì)·OH的清除作用見圖2，由圖可知，隨著多糖濃度的增加，各多糖樣品清除·OH能力逐步增強(qiáng)，其中總多糖作用最強(qiáng)，經(jīng)脫蛋白、脫色后其清除作用減弱。雖然該三種多糖樣品的清除·OH活性弱于Vc，但仍表現(xiàn)出較好的清除作用。

圖2　樣品和Vc對(duì)·OH的清除能力

2.3對(duì)DPPH·的清除作用

對(duì)DPPH·清除作用的測(cè)定結(jié)果如圖3所示，由該圖可知，各多糖樣品清除DPPH·的作用趨勢(shì)與上述清除·OH大致相同，總多糖活性最強(qiáng)，經(jīng)脫蛋白、脫色等純化后的多糖對(duì)DPPH·的清除作用減弱。在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，多糖濃度與DPPH·清除作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖3　樣品和Vc對(duì)DPPH·的清除能力

2.4對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用如圖4所示，由圖可知，各多糖樣品清除超氧陰離子自由基（）的作用趨勢(shì)與上述清除·OH和DPPH·大致相同，總多糖活性最強(qiáng)，經(jīng)脫蛋白、脫色純化后的多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用減弱。在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度增加清除作用逐漸增強(qiáng)。

圖4　樣品和Vc對(duì)O-2·的清除能力

3　討論

以上結(jié)果表明，從本實(shí)驗(yàn)所用的黨參復(fù)方中提取的多糖成分經(jīng)還原能力、清除·OH自由基、DPPH·自由基和O-2·自由基等多指標(biāo)的測(cè)定，均呈現(xiàn)較好的體外抗氧化能力，不同純化方法得到的黨參復(fù)方多糖之間的抗氧化活性存在差異，膜分離工藝制得的總多糖的抗氧化活性最強(qiáng)，經(jīng)脫蛋白、脫色等方法純化后其多個(gè)指標(biāo)的體外抗氧化活性均呈降低，由此推測(cè)黨參復(fù)方多糖中與其共存的蛋白質(zhì)、色素等成分可能與其活性相關(guān)。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，黨參復(fù)方多糖的活性隨其純化程度的增加而減弱。因此，當(dāng)開發(fā)利用多糖的活性時(shí)，不應(yīng)沿襲純化學(xué)工作思路盲目進(jìn)行脫蛋白、脫色。

綜上可知，黨參復(fù)方多糖的抗氧化活性，以及多糖活性與純化程度的相關(guān)性值得關(guān)注，有必要進(jìn)一步深入研究。與單味藥材的多糖成分相比，中藥復(fù)方中多糖成分的活性研究顯著偏少，然而中藥復(fù)方中的藥材配伍使用，君臣佐使協(xié)同增效是中醫(yī)藥的重要特色和優(yōu)勢(shì)，因此重視復(fù)方活性成分的研究正是中藥現(xiàn)代化研究和天然藥材純化學(xué)研究的本質(zhì)區(qū)別，由此而言，中藥復(fù)方中多糖成分或其它成分的活性研究意義更為突出，相關(guān)工作亟需加強(qiáng)。

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Study on antioxidantactivity ofpolysaccharidesfrom compound codonopsispilosula produced by differentm ethods

LIU Chao，ZHANG Yao-wu
（CollegeofChemicalEngineering，Qingdao University ofScienceand Technology，Shangdong Qingdao 266042，China）

Objective：To study the antioxidant activities of Codonopsis pilosula compound polysaccharides prepared by differentmethods，and explore the relationship between polysaccharide purification and its activity. Methods：Codonopsis pilosula compound polysaccharideswere isolated bymembrane separation，purified furtherby removing the protein and pigment.The antioxidant activities ofall polysaccharide productswere investigated using various assays in vitro，including reducing power and scavenging ability on hydroxyl radicals，DPPH radicals，superoxide radicals.Results：All the polysaccharides prepared by differentmethods showed antioxidant activity in vitro and good dose-effect relationships.The antioxidant activity of total polysaccharides became weaker after purifing by deproteinization and decoloration.Conclusion：Codonopsis pilosula compound polysaccharides had better antioxidant activity in vitro.When preparing active polysaccharide，proteins and pigments shouldn’t be removed blindly.

codonopsispilosula compound；polysaccharide；purification；antioxidantactivity；free radical

10.3969/j.issn.1008-1267.2015.05.006

TQ224.6

A

1008-1267（2015）05-0019-04

2015-04-28

劉超（1988），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離和中藥制劑現(xiàn)代化。