張　華，南文龍，鞏明霞，張悅勇，3，彭大新，陳義平

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島　266032；

2. 揚州大學獸醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點開放實驗室，江蘇揚州　225009；3.青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島　266109）

雞傳染性法氏囊病血清抗體間接ELISA檢測方法的建立

張華1，2，南文龍1，鞏明霞1，張悅勇1，3，彭大新2，陳義平1

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032；

2. 揚州大學獸醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病重點開放實驗室，江蘇揚州225009；3.青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島266109）

為建立可檢測雞傳染性法氏囊病血清抗體的間接ELISA檢測方法，本研究經(jīng)RT-PCR擴增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段，并應(yīng)用pET28a載體進行原核表達，親和層析純化重組蛋白作為包被抗原，建立檢測IBDV血清抗體的間接ELISA方法。應(yīng)用所建方法和IDEXX試劑盒，對采自不同地區(qū)的156份雞血清樣品進行平行檢測和比較。結(jié)果表明，RT-PCR擴增獲得708bp的VP2基因片段；含重組表達質(zhì)粒pET28a-VP2的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導后，表達了約27kDa的VP2重組蛋白，表達量約占菌體蛋白的30.1%；建立的間接ELISA檢測方法與IDEXX試劑盒比較，其特異性、敏感性和符合率分別達到90.24%、95.65%和94.23%。由此可見，本研究所建立的間接ELISA方法敏感、特異，適用于IBDV血清抗體的檢測。

傳染性法氏囊病；VP2；原核表達；間接ELISA

傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的雞的一種急性高度接觸性傳染?。?］。IBDV主要侵害法氏囊B淋巴細胞，導致免疫損傷，并誘發(fā)多種疫病以及疫苗免疫失?。?］。準確診斷和監(jiān)測是防控該病的關(guān)鍵，IBDV血清抗體檢測方法主要有瓊脂擴散和ELISA方法。瓊脂擴散試驗存在靈敏度較低、耗時長并且無法實現(xiàn)高通量檢測等缺陷。ELISA方法特異、敏感，并可實現(xiàn)高通量檢測，是IBDV血清抗體理想的檢測方法［3］。

VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是構(gòu)成病毒衣殼的主要成分，也是主要的宿主保護性抗原［4］。VP2基因全長約為1.4kb，有關(guān)研究顯示VP2蛋白的212～214和248～252 位氨基酸的兩個親水區(qū)分別與IBDV抗原結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和毒力大小有關(guān)［5］。本研究擬對VP2基因上半段進行原核表達，并以純化的重組蛋白作為檢測用抗原，建立檢測IBDV血清抗體的間接ELISA方法。

1　材料

1.1毒株及血清樣品

IBDV B87株及其陽性血清由青島易邦生物工程有限公司提供；H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽性血清、新城疫病毒陽性血清均由本室免疫SPF雞制備；SPF雞血清為本室采集保存；156份臨床雞血清樣品采自山東和江蘇的部分雞場（其中121份經(jīng)IBDV疫苗免疫，35份未免IBDV疫苗 ）。

1.2主要試劑

Taq DNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、內(nèi)切酶、病毒RNA提取試劑盒、pMD18-T克隆載體購自大連寶生物（TaKaRa）公司；pET-28a表達載體購自Life公司；Ni SepharoseTM 6 Fast Flow購自GE Healthcare公司；山羊抗雞IgG-HRP購自美國BETHYL公司；酶標板購自美國康寧公司。

2　方法

2.1IBDV VP2基因擴增

按試劑盒說明方法，提取IBDV B87株基因組RNA，Oligo（dt）常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。根據(jù)GeneBenk發(fā)表的IBDV VP2全基因序列，設(shè)計一對引物，P1：5'-TCGAATTCATGACAAACCTGCAAGATC-3'；P2：5'-GCTCTCGAGGGCATCGATATTAGCTG-3'，其中引物P1和P2的5'端分別引入EcoR I和Xho I酶切位點，擴增VP2基因1nt～708nt位置基因片段。引物由大連寶生物公司合成。反應(yīng)條件：94℃預變性4min；94℃變性40s，57℃退火40s，72℃延伸75s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，PCR 產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司測序。

2.2重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

回收VP2目的基因，連接pMD18-T載體，構(gòu)建陽性克隆質(zhì)粒pMD18-T-VP2。EcoR I、Xho I雙酶切pMD18-T-VP2和pET-28a載體，連接VP2基因與pET-28a載體，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-VP2［6］。

2.3重組蛋白的表達及純化

將重組表達質(zhì)粒pET-28a-VP2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，以終濃度為1mg/mL的IPTG 37℃誘導表達5h，12%SDS-PAGE凝膠電泳分析表達產(chǎn)物。常規(guī)方法回收包涵體蛋白，并經(jīng)鎳柱親和層析法純化，Qubit 2.0儀器測定重組蛋白濃度，Westernblot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性。

2.4間接ELISA方法的建立及條件優(yōu)化

以純化的VP2重組蛋白作為包被抗原，用0.05 M pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液進行倍比稀釋（濃度范圍8000ng/mL～250ng/mL），每孔加入100μL，4℃包被過夜。同時，將SPF雞陰性血清和IBDV陽性血清分別進行50倍、100倍、200倍和400倍稀釋，羊抗雞IgG-HRP酶標二抗按1∶5000稀釋，進行方陣測定，確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。然后再對各反應(yīng)時間以及酶標二抗工作濃度等條件逐一優(yōu)化。

2.5交叉反應(yīng)的檢測

用建立好的間接ELISA檢測方法對H5、H7、H9亞型禽流感病毒陽性血清以及新城疫病毒陽性血清進行檢測，觀察是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.6血清樣品檢測

用建立的間接ELISA方法檢測156份雞血清樣品，并用美國IDEXX公司的IBDV抗體ELISA檢測試劑盒平行檢測，比較分析檢測結(jié)果。

3　結(jié)果與分析

3.1IBDV VP2基因的擴增結(jié)果

IBDV VP2基因的RT-PCR擴增結(jié)果如圖1，擴增獲得708bp的VP2基因片段。

3.2重組克隆和表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將構(gòu)建的重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-VP2和表達質(zhì)粒pET-28a-VP2經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切，鑒定結(jié)果分別如圖2和圖3，兩者經(jīng)酶切均出現(xiàn)VP2目的基因條帶和載體條帶，大小同預期一致。

3.3IBDV VP2蛋白的表達以及抗原性分析

圖1　IBDV VP2基因RT-PCR 擴增結(jié)果

圖2　克隆載體pMD18-T-VP2雙酶切鑒定結(jié)果

圖3　表達載體pET-28a -VP2雙酶切鑒定結(jié)果

用BandScan軟件對SDS-PAGE結(jié)果（圖4）進行分析，結(jié)果表明在約27kDa處出現(xiàn)VP2重組蛋白表達，表達量約占大腸桿菌的30.1%。經(jīng)Qubit 2.0測定，純化后的VP2重組蛋白濃度為2.5mg/mL。Western-blot結(jié)果（圖5）顯示，VP2重組蛋白能與IBDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表達的VP2 蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖4　重組蛋白的SDS-PAGE 分析結(jié)果

圖5　重組蛋白Western-blot鑒定結(jié)果

3.4檢測IBDV血清抗體間接ELISA方法的建立方陣試驗結(jié)果見圖6，當抗原工作濃度為250ng/ mL和血清50倍稀釋時，P/N值雖然較大，但由于此時抗原濃度較小，所有樣品OD值總體偏低，會影響本方法的靈敏度。當抗原工作濃度為1000ng/ mL和血清100倍稀釋時，P/N值較為理想，易于分辨陰、陽性結(jié)果，選擇作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。

圖6　方陣試驗結(jié)果

進一步對反應(yīng)時間及酶標二抗工作濃度等條件進行優(yōu)化，最終確定的ELISA反應(yīng)程序：將純化的VP2 重組蛋白用用0.05mol/L pH 9.6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋至1000ng/mL，100 μL/孔包被酶標板，4℃包被過夜；PBST洗滌3 次，然后每孔加300μL 2% BSA封閉液，37℃封閉2h；PBST洗滌3次，分別加入100倍稀釋的待檢血清、陽性對照血清（2 個）和陰性對照血清（2個），每孔100μL，37℃孵育30min；PBST洗滌3 次，再每孔加入100μL 2500 倍稀釋的山羊抗雞IgGHRP，37℃孵育30 min；PBST洗滌3次，每孔加入100μL新配置的TMB顯色液，37℃顯色10 min；最后，每孔加入50μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。測定OD450值。分別計算出陽性對照平均值ODP和陰性對照平均值ODN，待檢血清樣品OD450＞0.6×ODP+0.4×ODN判定為陽性；待檢樣品OD450 ≤0.6×ODP+0.4×ODN判定為陰性。

3.5交叉反應(yīng)的檢測

交叉反應(yīng)檢測結(jié)果顯示，H5亞型禽流感病毒陽性血清、H7亞型禽流感病毒陽性血清、H9亞型禽流感病毒和新城疫病毒陽性血清經(jīng)檢測均為陰性，表明所建立的間接ELISA方法與禽流感、新城疫等常見病毒病陽性血清無交叉反應(yīng)。

3.6156份雞血清樣品檢測結(jié)果

利用所建立的間接ELISA方法（VP2-ELISA）與IDEXX ELISA檢測試劑盒平行檢測156份臨床血清樣品（表1）。VP2-ELISA檢測出114份陽性和42份陰性；IDEXX ELISA試劑盒檢測出115份陽性和41份陰性。但是，在IDEXX ELISA試劑盒檢測為陰性的41份樣品中，有4份樣品VP2-ELISA檢測為陽性；在IDEXX ELISA試劑盒檢測為陽性的115份樣品中，有5份樣品VP2-ELISA檢測為陰性。與IDEXX ELISA試劑盒相比， VP2-ELISA方法的特異性、敏感性和符合率分別為90.24%（37/41）、95.65%（110/115）和 94.23%（147/156）。

4　討論

Marquardt［6］于1980年首次將ELISA檢測技術(shù)應(yīng)用到IBD的診斷中，并成功地從臨床雞血清樣品中檢測出IBDV特異性抗體。2010年，Niraj［7］等將大腸桿菌中表達的IBDV VP3蛋白和酵母菌中表達的VP2蛋白以及疫苗株全病毒抗原進行包板，分別建立了檢測IBD血清抗體的間接ELISA方法：VP3-ELISA 、VP2-ELISA和W-ELISA，比較發(fā)現(xiàn)VP3-ELISA和VP2-ELISA檢測結(jié)果相似，而W-ELISA的特異性和敏感性相對較差。其中，VP2-ELISA與病毒中和試驗相比，其符合率、特異性和敏感性達到95%、95.9%和96.1%，效果與IDEXX ELISA試劑盒相當。國內(nèi)也有相關(guān)的研究報道，馬秀麗等［8］建立了全病毒作為檢測抗原建立了間接ELISA方法，與進口試劑盒相比，符合率達到86.7%；宋軍等［9］也報道了VP2間接ELISA方法，并證明該方法具有良好的特異性。為了提高表達量及獲得理想的檢測效果，研究過程中我們曾分段表達了VP2基因，包括上半段（1nt-708nt）、下半段（652nt-1353nt）和全長（1nt-1353nt）。結(jié)果顯示，VP2上半段基因基因表達效果較好。而且，我們還將VP2上半段基因、下半段基因以及全基因重組蛋白均作為檢測抗原，包被酶標板，比較了三者ELISA方法的檢測效果。結(jié)果表明，應(yīng)用VP2上半段基因建立的ELISA方法，檢測時陰性樣品背景值較低，陽性樣品OD值較高，P/N值大，更易于陰、陽性結(jié)果的分辨。因此，本研究最終選擇以VP2上半段基因重組蛋白作為檢測抗原，優(yōu)化建立了檢測IBDV血清抗體的間接ELISA方法。與IDEXX ELISA試劑盒相比，本方法符合率94.23%、特異性90.24%、敏感性95.65%，檢測效果較為理想，可用于臨床IBDV血清抗體的檢測。

表1 VP2-ELISA和INDEXX ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較

［1］ Hair-Bejo M，Ng M K，Ng H.Y. Day Old Vaccination Against Infectious Bursal Disease in Broiler Chickens［J］. International Journal of Poultry Science，2004，3（2）：124-128.

［2］ Martínez-Torrecuadrada J L，Lázaro B，Rodriguez J F，et al. VPX and VP3 Infectious Bursal Disease Virus Proteins Potential of Baculovirus-Expressed Antigenic Properties and Diagnostic［J］. Clinical and Vaccine Immunology，2000，7（4）：645- 651.

［3］ 陳義平，鄧珣，彭長凌，等.PRRSV血清抗體間接ELISA檢測方法的建立［J］.揚州大學學報，2006，27（4）：1-4.

［4］ Zanetti F A，Del Médico Zajac M P，Taboga O A，et al. Evaluation of modifi ed vaccinia virus Ankara expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus as an immunogen in chickens［J］. Journal of Veterinary Science，2012， 13（2）：199-201.

［5］ Bayliss C D，Spies U，Shaw K，et a1. A comparison of segment A of four infectious bursal disease virus strains and identification of a variable region in VP2 ［J］. Journal of General Virology，1990，71（6）：1303-1312.

［6］ 周潔，陳義平，楚電峰，等.豬細小病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2主要抗原表位區(qū)基因的克隆及原核表達［J］.中國動物檢疫，2009，26（2）：42-44.

［7］ Singh N K，Dey S，Madhan Mohan C， et al. Evaluation of four enzyme linked immunosorbent assays for the detection of antibodies to infectious bursal disease in chickens［J］. Journal of Virological Methods，2010，65（2）：277-282.

［8］ 馬秀麗，崔言順，張秀美，等.雞傳染性法氏囊病間接ELISA診斷試劑盒的研制及初步應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學報，2003，23（5）：424-426.

［9］ 宋軍，黃成斌，單雪芹，等.傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的表達及間接ELlSA抗體檢測方法的建立［J］. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2011，38（4）：633-636.

（責任編輯：胡藕祥）

Development of an Indirect ELISA for the Detection of Antibodies against Infectious Bursal Disease Virus in Chickens

Zhang Hua1，2，Nan Wenlong1，Gong Mingxia1，Zhang Yueyong1，3，Peng Daxin2，Chen Yiping1
（1.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Key Laboratory of Animal Infectious Diseases， Ministry of Agriculture，College of Veterinary Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009；3. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shangdong 266109）

In order to develop an indirect ELISA for the detection of antibodies against IBDV， VP2 gene（1nt～708nt）was amplifi ed by RT-PCR and expressed using the pET-28a vector in Escherichia coli BL21. The recombinant protein was purifi ed through Ni-chelating affi nity chromatography and based on it，an indirect ELISA was developed. To verify the performance of this assay， 156 clinical serum samples were detected by the assay and IDEXX ELISA kit in parallel. The results showed that VP2 gene was successfully amplifi ed by RT-PCR and expressed in E.coli BL21 with IPTG induction. Compared to IDEXX ELISA kit， the specifi city，sensitivity，and coincidence rate of the developed indirect ELISA were 90.24%，95.65% and 94.23% respectively.The results demonstrated the assay was sensitive and specifi c，and could be used to detect antibodies against IBDV in chicken sera.

IBDV；VP2；prokaryotic expression；indirect ELISA

S852.65+7

A

1005-944X（2015）09-0072-05

陳義平