李 冰 ，白桂芬，謝 艷

（內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個組成部分，在食物鏈中是土壤生物與陸地生物之間傳遞的橋梁[1].由于蚯蚓具有獨特的生物學(xué)作用，已被用于監(jiān)測和指示土壤污染、評價外源污染物對土壤生態(tài)環(huán)境安全性的影響等方面[2].敵百蟲是內(nèi)蒙古赤峰市區(qū)蔬菜大棚經(jīng)常使用的廣譜有機磷殺蟲劑.目前敵百蟲作用于哺乳動物、魚類和昆蟲等動物的研究較多[3-8]，也有關(guān)于重金屬對蚯蚓影響的研究[2]，但敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)解毒酶活性影響的報道尚未發(fā)現(xiàn).

自然界中的各種生物為避免受到內(nèi)源性或外源性化學(xué)物質(zhì)刺激，在進(jìn)化過程中形成了一系列的代謝解毒酶系統(tǒng)[9].谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是其中最重要的酶系之一，它可清除生物體內(nèi)的脂類過氧化物，催化谷胱甘肽（GSH）與親電性中間代謝物結(jié)合，使之成為水溶性化合物排出體外，起到解毒作用，在植物、無脊椎動物和脊椎動物對重金屬、殺蟲劑以及除草劑等異源物質(zhì)的解毒代謝中具有重要作用.在以蚯蚓作為指示動物的毒理學(xué)研究中，GSTs活性的誘導(dǎo)作用也常被作為指示重金屬和殺蟲劑污染的潛在分子標(biāo)志物[10].乙酰膽堿酯酶（AChE）在蚯蚓的神經(jīng)傳遞過程中起著重要作用，此酶主要用于評價有機磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對蚯蚓的毒性情況.它廣泛存在于動物組織中，能夠特異性催化乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能[11].有機磷農(nóng)藥能夠作用于神經(jīng)突觸中的AChE，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)功能的紊亂[12].羧酸酯酶（CarE）是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系[13]，也是蚯蚓體內(nèi)重要的解毒酶之一.

本實驗采用濾紙接觸法，研究敵百蟲對蚯蚓的生態(tài)毒理效應(yīng)以及敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)的GSTs、AChE和CarE活性的影響.這一研究旨在明確敵百蟲對土壤生物的毒性效應(yīng)，為敵百蟲對環(huán)境生物的影響做出早期預(yù)警，也為合理判定敵百蟲對相關(guān)動物的毒害程度積累基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

供試動物：采集赤峰市區(qū)蔬菜大棚中質(zhì)量為300～500 mg、大小一致、環(huán)帶明顯的健康成蚓.

供試敵百蟲：南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號為XK13-200-00095，農(nóng)藥登記號為PD84108-5，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號為GB334-2001.本研究采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%的敵百蟲原藥.

1.1.2 主要儀器與試劑

HC-2518小型冷凍高速離心機，由科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)；ModeL680酶標(biāo)儀，由BIORAD公司生產(chǎn)；GSTs測定試劑盒（型號：CK-E11062H）、AChE測定試劑盒（型號：CK-E10986H）、羧酸酯酶測定試劑盒（型號：CK-E11517H），均由南京建成生物工程研究所提供；磷酸二氫鈉，由沈陽市華東試劑廠生產(chǎn).

1.1.3 污染物實驗質(zhì)量濃度的設(shè)計

參照文獻(xiàn)[6]，設(shè)定敵百蟲質(zhì)量濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 和 0.07 g/L.

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒理實驗

急性毒理實驗方法參照白桂芬等[6]所做的敵百蟲單一急性毒性實驗.敵百蟲處理蚯蚓后，實驗室內(nèi)常溫培育48h，觀察記錄蚯蚓的死亡情況.

1.2.2 酶源制備

參照陳東亞等[7]的方法，于相同質(zhì)量濃度梯度的3個培養(yǎng)皿中隨機取處理后的蚯蚓2條，用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸取體表多余的水分，稱重.GSTs的提取中按質(zhì)量體積比1∶9加入0.1 moL/L、pH值6.5的磷酸鹽緩沖液（AChE的提取中加入1/15 moL/L、pH值8.0的磷酸鹽緩沖液；CarE的提取中加入0.2 moL/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液），加入石英砂冰浴勻漿，于冷凍高速離心機中4℃、GSTs與CarE在4 000 r/min、AchE在6 500 r/min下離心15 min后，取上清液作酶源，在4℃下保存?zhèn)溆?

1.2.3 解毒酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)3種解毒酶試劑盒的操作程序，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制解毒酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)Excel軟件處理后得到3種酶的線性回歸方程，分別如下：

式中：y為測得的OD值；x為酶活性；R為相關(guān)系數(shù).

根據(jù)線性回歸方程可計算在不同敵百蟲質(zhì)量濃度下3種酶的酶活性.

1.2.4 酶活性的測定

參照試劑盒測試的要求進(jìn)行操作.

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0和EXCEL分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理.

2 結(jié)果

2.1 敵百蟲對蚯蚓的急性毒理

在染毒48h后，各質(zhì)量濃度敵百蟲處理下的蚯蚓中毒癥狀及其死亡率與白桂芬等[6]得到的結(jié)果基本一致.蚯蚓表現(xiàn)出中毒癥狀，如身體柔軟，環(huán)節(jié)較松弛，體色變深，有明顯滲血現(xiàn)象，并且有黃色液體滲出.部分體節(jié)腫大，生殖環(huán)糜爛.敵百蟲各質(zhì)量濃度污染暴露48h對蚯蚓均產(chǎn)生致死效應(yīng)，且蚯蚓死亡率隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的增大而升高，在實驗設(shè)定的最高質(zhì)量濃度時，蚯蚓的死亡率達(dá)70%左右.

2.2 敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)酶活性的影響

在毒理實驗的基礎(chǔ)上研究不同質(zhì)量濃度敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)解毒酶活性的影響，結(jié)果如表1所示.

表1 各質(zhì)量濃度敵百蟲作用下蚯蚓體內(nèi)解毒酶的活性Tab.1 Activity of detoxifying enzyme in earthworm treated with different massconcentrations of trichlorphon

2.2.1 敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)GSTs活性的影響

表1顯示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的敵百蟲染毒處理48h后，同對照組相比，蚯蚓體內(nèi)的GSTs活性均顯著增加，處于激活狀態(tài).敵百蟲質(zhì)量濃度為0.06 g/L時，蚯蚓體內(nèi)的GSTs活性達(dá)到最大，與對照組相比提高了79.5%.在敵百蟲質(zhì)量濃度小于0.06 g/L時，隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的增加，蚯蚓GSTs的活性總體上呈增加趨勢；敵百蟲質(zhì)量濃度超過0.06 g/L時，蚯蚓GST的活性又急劇下降.

2.2.2 敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)AChE活性的影響

不同質(zhì)量濃度的敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)AChE活性的影響程度不同.由表1可見，敵百蟲質(zhì)量濃度較低時，能夠激發(fā)蚯蚓體內(nèi)AChE的合成能力，加快合成速度，使AChE含量上升[9].敵百蟲質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 g/L時，蚯蚓體內(nèi)的AChE活性達(dá)到最大值.此后，隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的進(jìn)一步升高至0.05 g/L，AChE活性下降，但仍高于對照組.敵百蟲質(zhì)量濃度繼續(xù)升高至0.06 g/L后，蚯蚓體內(nèi)的AChE活性低于對照組，即AChE的合成處于抑制狀態(tài).

2.2.3 敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)Car E活性的影響

不同質(zhì)量濃度的敵百蟲作用于蚯蚓后，總體上處理組CarE活性高于對照組，即呈現(xiàn)促進(jìn)作用.由表1可見，敵百蟲質(zhì)量濃度為0.04 g/L時，CarE活性達(dá)到最大；當(dāng)敵百蟲質(zhì)量濃度小于0.04 g/L時，CarE活性隨敵百蟲質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢，說明敵百蟲在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對CarE活性的促進(jìn)作用隨著質(zhì)量濃度的增加不斷加強；當(dāng)敵百蟲質(zhì)量濃度大于0.04 g/L時，CarE活性呈下降趨勢，即敵百蟲在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨著質(zhì)量濃度的增加對CarE活性的促進(jìn)作用減弱.總之，敵百蟲對蚯蚓體內(nèi)的CarE有誘導(dǎo)作用，且低質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)作用強于高質(zhì)量濃度.

3 討論與結(jié)論

本研究采用不同質(zhì)量濃度的敵百蟲作用于蚯蚓，發(fā)現(xiàn)在研究的敵百蟲質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蚯蚓有中毒癥狀及死亡現(xiàn)象，且死亡率與敵百蟲質(zhì)量濃度呈正比關(guān)系.測定蚯蚓在染毒48h后體內(nèi)解毒酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蚯蚓體內(nèi)GSTs、AChE和CarE 3種解毒酶的活性均是先隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的升高而增加，這可能是機體對敵百蟲農(nóng)藥的適應(yīng)性反應(yīng)，解毒酶活性的提高有助于減少異源物質(zhì)對機體的損傷，該結(jié)果與吳咚咚等[11]的發(fā)現(xiàn)相似.在一定質(zhì)量濃度下解毒酶活性達(dá)到峰值后，隨著敵百蟲質(zhì)量濃度的進(jìn)一步提高，解毒酶活性下降，甚至低于對照組.3種解毒酶均是在敵百蟲質(zhì)量濃度為0.04 g/L活性很大，即該質(zhì)量濃度下蚯蚓體內(nèi)的解毒酶活性被充分激發(fā)，參與蚯蚓對有機磷類藥劑的代謝作用.當(dāng)敵百蟲施用量超過蚯蚓機體承受范圍時，解毒酶的活性急劇下降，蚯蚓所受毒害作用不可修復(fù).

本研究為探討蚯蚓抗藥性機制，建立抗性生化檢測提供理論依據(jù)，也為合理使用農(nóng)藥減少其不良負(fù)作用積累基礎(chǔ)資料.

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