吳小惠　朱翠平

·論著·

GLUT-4基因多態(tài)性與危重患兒高血糖的臨床研究

吳小惠朱翠平★

目的 探討葡萄糖轉運蛋白-4（GLUT-4）基因多態(tài)性與危重患兒高血糖發(fā)生風險的相關性。方法 PICU住院治療的危重患兒58例根據入院時血糖情況分為血糖正常組和血糖增高組，正常兒童為對照組，提取各組血樣基因組DNA，PCR擴增GLUT-4基因并測序，比較組間基因型和基因分布頻率的差異。結果 （1）血糖增高組﹑血糖正常組和對照組的血糖分別為（9.83±2.48）mmol/L，（4.82±0.76）mmol/ L，（4.49±0.81）mmol/L（P＜0.05）。（2）危重患兒GLUT-4基因發(fā)現(xiàn)4個單核苷酸多態(tài)性位點735C/T（rs222848）﹑808C/T（rs222849）﹑969C/T（rs16956647）以及2070C/T（rs5435）。（3）危重患兒GLUT-4基因735CC基因型個體中血糖增高45例，血糖正?；純?3例，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（4）808CC﹑808TC﹑2070CC和2070TC基因型個體危重應激下高血糖發(fā)生風險增高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（5）969TT和969CT基因型個體危重應激下高血糖發(fā)生風險降低（OR=0.16，95%CI：0.017-1.48；OR=0.41，95%CI：0.11～1.62），但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論 GLUT-4基因發(fā)現(xiàn)有4個單核苷酸多態(tài)性位點735C/T﹑808C/T﹑969C/T和2070C/T，但各基因型個體與兒童危重病高血糖發(fā)病風險無相關性。

危重癥 兒童 高血糖 GLUT-4 基因多態(tài)性

高血糖是危重患兒常見的糖代謝紊亂［1］，其水平高低不僅反映體內激素分泌異常、疾病嚴重程度，還與危重病病死率及并發(fā)癥增加密切相關［2，3］。葡萄糖轉運蛋白-4（GLUT-4）是受胰島素調控、維持機體糖代謝平衡的主要糖載體［4］，目前兒童危重癥高血糖的發(fā)病機制尚未明確，作者取58例危重患兒外周血DNA，經PCR擴增并測序對GLUT-4基因多態(tài)性進行分析，以確定是否存在GLUT-4基因變異，從而判斷其蛋白產物可能的作用改變與血糖異常的關系。

1　臨床資料

1.1一般資料 2012年7月至2013年7月本院PICU住院治療的危重患兒58例，其中男42例，女16例；年齡0.17～14歲，平均（3.55±3.72）歲，其中年齡＜1歲23例，1～5歲21例，＞5歲14例。按照《2008年嚴重膿毒癥和膿毒性休克治療國際指南》［5］符合膿毒癥診斷39例，其基礎疾病包括膿毒癥11例、肺炎17例、腹瀉病2例、顱內感染9例。外科術后患兒19例，其中先天性心臟病體外循環(huán)修補術后患兒12例，嚴重外傷術后患兒7例。選擇正常兒童43例為對照組，其中男26例，女17例；年齡0.17～10.0歲，平均（3.06±2.79）歲，其中年齡＜1歲15例、1～5歲17例、＞5歲11例。排除標準：有原發(fā)性糖代謝異?；蚶^發(fā)影響糖代謝疾病的患兒。各組兒童均為廣東地區(qū)漢族兒童。本項目經本院醫(yī)學倫理委員會審核批準并經各組兒童監(jiān)護人的知情同意。

1.2方法 （1） 血液標本采集：危重患兒于本院急診觀察室就診時采取靜脈血，均為空腹且未予外源性葡萄糖靜脈輸注；正常對照組為晨8時空腹采集靜脈血，并同時測定微量血糖。（2） 血糖檢測：采用美國強生公司生產的Surestep微量血糖檢測儀及配套試紙進行血糖監(jiān)測，血糖≥6.1mmol/L為高血糖，2.8～6.09mmol/ L為正常血糖；第一次血糖升高且30min后再復查仍高，即定為高血糖。（3）DNA提?。喝?50μl全血，采用血DNA提取試劑盒（日本東洋紡公司）抽提DNA，分光光度儀（Thermo，NANO Diop 2000）檢測并在2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像儀（Biorad gel doc-xr）觀察結果。（4）GLUT-4片段基因引物設計：引物設計根據GLUt-4序列（GenBank，GeneID 6517），采用DNAman（version3.0）共設計5對引物（見表1），并由上海博尚生物技術有限公司合成，擴增的目的片段長度5815 bp，5對引物擴增片段區(qū)域為197-6012 bp。（4） PCR擴增：PCR（25μl）擴增體系為10×PCR緩沖液2.5μl，2.5 μmol/LdNTP 2μl，引物F 0.5μl，引物R 0.5μl，DNA模板1μl，TaqDNA 聚合酶0.3μl，去離子水18.2 μl。PCR程序為94℃ 5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共35個循環(huán)；72℃再次延伸5min，4℃保存。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，并用凝膠成像儀觀察結果。將PCR產物送到廣州華大基因有限公司測序，上樣于ABI-3730XL測序儀進行單向測序。DNA測序圖譜中多態(tài)性位點僅有1個峰為純合基因型，出現(xiàn)雙峰則表示其為雜合基因型。

表1　GLUT-4 基因PCR引物序列及其擴增產物長度

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示；用秩和檢驗；兩組率的比較采用χ2檢驗；采用非條件Logistic回歸分析，以OR值及95% CI表示各基因型與危重癥高血糖易感性的相關性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1危重患兒血糖情況 根據入院時的血糖情況分為血糖正常組和血糖增高組。血糖增高組、血糖正常組和對照組的血糖分別為（9.83±2.48）mmol/L，（4.82±0.76）mmol/L，（4.49±0.81）mmol/L，3組間的血糖值差異有統(tǒng)計學意義（χ2=48.94，P=0.000）；血糖增高組血糖值高于血糖正常組、正常對照組（P=0.000），但后兩者差異無統(tǒng)計學意義（P=0.280）。

2.2GLUT-4的DNA測序分析 該基因測序發(fā)現(xiàn)有4個單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，分別是735C/T（rs222848）、808C/T（rs222849）、969C/T（rs16956647）以及2070C/T（rs5435）。經χ2檢驗各組中4個位點各基因分布頻率均符合Hardy Weinberg遺傳平衡（均P＞0.05），具有群體代表性。58例危重患兒GLUT-4基因SNP位點變異情況，見表2。

表2　GLUT-4基因4個位點變異情況［n（%）］

2.3危重患兒GLUT-4基因多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率分布 見表3。

表3　GLUT-4基因型及等位基因頻率在危重患兒和正常兒童的分布［n（%）］

3　討論

高血糖是危重癥患者常見的糖代謝紊亂，其促炎、致組織損傷等作用對危重病進展至關重要［6］。GLUT-4介導的葡萄糖易化轉運是脂肪、骨骼肌、心肌等胰島素敏感組織糖代謝的主要限速步驟，對于全身血糖內穩(wěn)態(tài)的調控具有重要意義［4］。細胞中GLUT-4表達減少及其轉位障礙是導致胰島素抵抗繼而引起危重癥高血糖發(fā)生的重要因素［7，8］。

本資料結果顯示GLUT-4有4個單核苷酸多態(tài)性位點735C/T、808C/T、969C/T和2070C/T，但各基因型及等位基因分布頻率與危重患兒高血糖發(fā)生風險無顯著相關性，表明GLUT-4 4個基因多態(tài)性位點單個堿基變異所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質氨基酸序列。研究認為在GLUT-4基因多態(tài)性與小鼠2型糖尿病易感性的探討中發(fā)現(xiàn)GLUT-4基因8521bp T→A堿基變異可引起GLUT-4mRNA表達降低，導致細胞內葡萄糖轉運能力下降［9］，與本實驗發(fā)現(xiàn)的GLUT-4基因多態(tài)性位點不同。但在急性應激狀態(tài)下，體內炎癥“瀑布”產生大量的TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥介質，使p38絲裂原活性蛋白激酶激活，可致GLUT-4基因表達減少以及GLUT-4的mRNA半衰期縮短，從而導致GLUT-4表達減少，使GLUT-4跨膜轉位減少，引起葡萄糖轉運障礙，從而產生胰島素抵抗［10］。Perrini等［11］發(fā)現(xiàn)氧化應激可使3T3-L1脂肪細胞中GLUT-4mRNA和蛋白含量降低，其作用機制為細胞核蛋白質被氧化后與GLUT-4啟動子的結合力下降。國外Zisman［12］等學者發(fā)現(xiàn)GLUT-4基因敲除的組織發(fā)生胰島素抵抗，而Carvalho［13］發(fā)現(xiàn)脂肪組織GLUT-4表達上調可增加機體胰島素敏感性，其次Chen等［14］在KKAy小鼠2型糖尿病動物模型，發(fā)現(xiàn)利拉魯肽［人胰高糖樣肽-1（GLP-1）類似物］可促進機體糖酵解、糖原合成及上調靶器官組織GLUT-4基因表達水平，有助于改善機體糖代謝紊亂及胰島素抵抗。目前在危重應激狀態(tài)下對GLUT-4的表達調控機制尚不明確的情況下，GLUT-4有望成為臨床上危重癥高血糖發(fā)生的潛在藥物治療新靶點，要完全闡明這一系列的問題并將研究成果應用于臨床仍需進一步研究。

國內外研究對危重患兒高血糖發(fā)生機制的認識目前尚不統(tǒng)一，受體前水平胰島素分泌減少、胰島素受體發(fā)出信號改變、GLUT-4表達水平下調等，均可導致GLUT-4轉位及葡萄糖吸收降低。Jeschke等［15］學者研究發(fā)現(xiàn)20例燒傷患兒的脂肪、骨骼肌胰島素受體（IR）、胰島素受體底物（IRS）、磷脂酰酯醇-3-激酶（PI3K）等相關蛋白表達水平下降，認為胰島素信號傳遞障礙是導致GLUT-4轉位受阻繼而引起胰島素抵抗的主要原因。另一方面，國外Verhoeven等［16，17］學者研究發(fā)現(xiàn)炎癥刺激可引起腦膜炎球菌膿毒癥患兒有不同程度的胰腺組織損傷，同時機體出現(xiàn)低胰島素血癥和高血糖并存現(xiàn)象，認為高血糖的發(fā)生主要是由于胰島β細胞功能障礙導致胰島素分泌相對不足引起。本研究中未發(fā)現(xiàn)GLUT-4 735C/T、808C/T、969C/T以及2070C/T多態(tài)性位點各基因型在危重患兒和正常兒童間的頻率分布差異有統(tǒng)計學意義，考慮在疾病病理進展的不同階段機體復雜的代謝及內分泌紊亂，引起高血糖的發(fā)生主導病理機制不同。

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Objective To assess the polymorphisms of Glucose Transporter-4（GLUT-4） gene with hyperglycemia in critically ill children. Methods Selected the critically ill children who suffered sepsis and systemic inflammatory response syndrome（SIRS） in Emergency Department as the research object. According to blood glucose，they were divided into two groups the normal glucose group and the hyperglycemia group. Healthy children as normal control group. Extracted DNA from peripheral blood，PCR amplifi cation and sequencing of the gene GLUT-4. Compared in each group by differences in the frequency distribution of genotypes. Using SPSS13.0 statistical software for analysis. Results （1）The blood glucose of the hyperglycemia group，the normal glucose group and the normal control group were 9.83±2.48 mmol/L，4.82±0.76 mmol/L，4.49±0.81 mmol/L（P＜0.05）；（2） Discovered 4 single nucleotide polymorphism of GLUT-4 gene in 735C/T（rs222848），808C/T（rs222849），969C/T（rs16956647）and 2070C/T（rs5435）.（3） A 735CC genotype is of 45（77.6%） with hyperglycemia in critically ill children，and of 13（22.4%） with normal blood glucose，but compared with normal children 43（100%），the difference was not statistically significant（P＞0.05）；（4）A 808CC，a 808TC，a 2070CC and a 2070TC genotype of GLUT-4 gene was associated with increased risk of hyperglycemia in critically ill children，but the difference was not statistically signifi cant（P＞0.05）；（5） A 969TT and a 969CT genotype of GLUT-4 gene was associated with decreased risk of hyperglycemia in critically ill children（OR=0.16，95%CL：0.017-1.48；OR=0.41，95%CL：0.11-1.62），but the difference was not statistically signifi cant（P＞0.05）. Conclusions Discovered 4 single nucleotide polymorphism of GLUT-4 gene in 735C/T（rs222848），808C/T（rs222849），969C/T（rs16956647）and 2070C/T（rs5435），but its genotypes were not associated with the risk of hyperglycemia in critically ill children.

Critical illness Children Hyperglycemia GLUT-4 Polymorphisms

廣東省廣州市科技局科技支撐項目（2008Z1-E291）

510000 廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心急診科