劉　媛，王　健，牟建樓，孫劍鋒，王　頡，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定　071000；2.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口　075000）

海灣扇貝多肽混合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

劉媛1，2，王健2，牟建樓1，孫劍鋒1，王頡1，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定071000；2.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口075000）

采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測(cè)海灣扇貝多肽混合物對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，利用倒置顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察、分析其對(duì)HepG2細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明：不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL）能夠抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，且抑制率隨海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度的增加而升高。經(jīng)12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理后，HepG2細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、透明度降低、細(xì)胞核固縮等，并出現(xiàn)了凋亡小體。海灣扇貝多肽混合物可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

海灣扇貝多肽；HepG2細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

惡性腫瘤又稱為癌癥，它是目前嚴(yán)重威脅人類生命和影響人類健康的主要疾病之一。海洋生物來(lái)源的抗腫瘤活性物質(zhì)具有毒副作用小、藥效高的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為天然抗癌藥物極好的潛在資源。扇貝是海洋生物的一種，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且含有多種生理活性成分，在海洋抗癌藥物研究［1-6］中具有很好的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景。本研究團(tuán)隊(duì)已通過(guò)酶解技術(shù)、反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）和串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜等方法從海灣扇貝中獲得了包含5 個(gè)組分的海灣扇貝多肽混合物［7-8］。為了探討所得海灣扇貝多肽混合物的抗腫瘤活性及其抑瘤機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其體外抗腫瘤活性及機(jī)制進(jìn)行初步研究和探討，為將海灣扇貝多肽混合物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為天然抗腫瘤活性成分奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞由河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心惠贈(zèng)。

RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）美國(guó)Gibco公司；胎牛血清天津市川頁(yè)生化制品有限公司；細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）上海同仁化學(xué)公司；慶大霉素鄭州羚銳制藥有限公司；AnnexinⅤ-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒美國(guó)BD公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

FACS-AriaⅡ型流式細(xì)胞儀美國(guó)BD公司；Ti-U熒光倒置顯微鏡日本Nikon公司；SpectraMax M2e多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)美國(guó)Molecular Devices公司；HEPA class 100 CO2培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo Electron公司；1300 SERIES A2生物安全柜美國(guó)Thermo Fisher公司；TDL-50B低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；D-1型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司。

1.3方法

1.3.1人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和終效價(jià)為100 IU/mL的慶大霉素，調(diào)整pH值至7.4，將人肝癌HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，加入上述RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)，每24 h換液1 次，直至細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物處理。

1.3.2海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

采用CCK-8法［9-10］檢測(cè)海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后，配成5×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，100 μL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，棄培養(yǎng)液。設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)，于24 h后檢測(cè)海灣扇貝多肽混合物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率。檢測(cè)前4 h加入CCK-8試劑（20 μL/孔）， 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定吸光度（A490nm），按照下式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4 個(gè)重復(fù)孔。

1.3.3海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

取經(jīng)傳代培養(yǎng)、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后配成5×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，分別接種于6 個(gè)50 mL的培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照［11］。

1.3.4海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

采用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后，配成1×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，分別接種于6 個(gè) 50 mL的培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，1 500 r/min離心7 min，收集細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）洗滌2 次，用標(biāo)記緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，吹打混勻后取100 μL細(xì)胞懸液加入5 mL培養(yǎng)管，分別加入5 μL AnnexinⅤ-PE及5 μL 7-AAD-PerCP-Cy5.5，混勻后避光染色20 min，加入400 μL標(biāo)記緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀況［12］。

1.3.5海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞p53、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后，配成1×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，分別接種于6 個(gè)50 mL的培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物（4、6、8、10、12 mg/mL，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋），對(duì)照組加入等體積RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，1 500 r/min離心7 min，收集細(xì)胞，用PBS（pH 7.4）洗滌3 次，最后1 次移入1 mL離心管中，分別加入等量預(yù)熱的細(xì)胞固定液，振蕩器低速振蕩混勻，37 ℃孵育15 min，經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后，配成1×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心7 min，收集細(xì)胞，加入1 mL破膜劑進(jìn)行細(xì)胞破膜。振蕩器低速振蕩混勻細(xì)胞，冰上孵育30 min，清洗細(xì)胞。用緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞終濃度為1×106個(gè)/mL，每個(gè)處理取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入20 μL PE-p53或PE-Bcl-2孵育20 min，振蕩器低速振蕩混勻細(xì)胞，冰上孵育30 min，清洗細(xì)胞，加入約500 μL緩沖液重懸細(xì)胞，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)［13］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析。采用t檢驗(yàn)分析兩組間差異，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)分析，P＜0.05和P＜0.01表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1海灣扇貝多肽混合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

海灣扇貝多肽混合物作用于體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，采用CCK-8法檢測(cè)，結(jié)果顯示各質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均出現(xiàn)不同程度的抑制作用，結(jié)果如圖1所示。

圖1　海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1　Inhibitory effect of bay scallop polypeptide mixture on the proliferation of HepG2 cells

由圖1可知，5 個(gè)不同質(zhì)量濃度（4、6、8、10、12 mg/mL）海灣扇貝多肽混合物作用HepG2細(xì)胞24 h，對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有明顯的抑制效果，并且隨著多肽質(zhì)量濃度增加，抑制率也隨之增加，且與對(duì)照組相比均有極顯著差異（P＜0.01）。

2.2海灣扇貝多肽混合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

用倒置顯微鏡觀察海灣扇貝多肽混合物作用24 h后HepG2細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。

圖2　海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig.2　Effect of bay scallop polypeptide mixture on morphology of HepG2 cells cultured in vitro

由圖2可知，對(duì)照組（圖2a）HepG2細(xì)胞透亮，形態(tài)飽滿，呈梭形或多突起形，突起部分較長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，緊密連接成片，細(xì)胞核較大，位于細(xì)胞中心。而不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物處理24 h后，實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞總數(shù)不斷變少，個(gè)體瘦小，出現(xiàn)不同程度的突起短縮、逐漸變圓，胞漿減少，且可見(jiàn)大小不等的空泡，細(xì)胞膜局部均向外出現(xiàn)一定程度的膨出-出芽現(xiàn)象。隨海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度的提高，上述改變更加明顯，尤其以12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組變化最為明顯，HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核固縮、碎裂，呈圓形、卵圓形或腎形，被擠向細(xì)胞一側(cè)，且出芽細(xì)胞更加多見(jiàn)，有的呈現(xiàn)典型的玫瑰花環(huán)狀。以上結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物處理24 h后，HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了不同程度的抑制。

2.3海灣扇貝多肽混合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

以海灣扇貝多肽混合物作用HepG2細(xì)胞24 h后，用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡試劑盒經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3　海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.3　Effect of bay scallop polypeptide mixture on apoptosis of HepG2 cells

由圖3可知，與對(duì)照組（0 mg/mL）相比，各質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物組HepG2細(xì)胞的死亡或晚期凋亡率和自發(fā)早期凋亡率均顯著升高（P＜0.05），且隨海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也相應(yīng)升高，兩者成正相關(guān)。當(dāng)海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞死亡或晚期凋亡率達(dá)到（17.69±0.04）%。以上結(jié)果說(shuō)明，海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。

以AnnexinⅤ-PE（標(biāo)記凋亡細(xì)胞）熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)、7-AAD-PerCP-Cy5.5（標(biāo)記死亡細(xì)胞）熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，采用流式細(xì)胞儀測(cè)得的散點(diǎn)圖如圖4所示。

圖4　HepG2細(xì)胞的流式散點(diǎn)圖Fig.4　Flow cytometric graphs showing the effect of bay scallop polypeptide mixture on apoptosis of HepG2 cells

由圖4可知，與對(duì)照組（圖4a）相比，各質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物組在Q2象限均出現(xiàn)了標(biāo)記的死亡或晚期凋亡細(xì)胞，在Q4象限均出現(xiàn)了標(biāo)記的早期凋亡細(xì)胞。隨著海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度的增加，Q2象限和Q4象限標(biāo)記的細(xì)胞逐漸增多，當(dāng)海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí)，Q2象限和Q4象限標(biāo)記的細(xì)胞最多。以上結(jié)果證明，海灣扇貝多肽混合物作用于體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，對(duì)HepG2細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡均有一定的誘導(dǎo)作用，且隨著海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度的增大，其誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞早期和晚期凋亡的作用也逐漸增強(qiáng)，12 mg/mL時(shí)效果最明顯。

2.4海灣扇貝多肽混合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞p53、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

海灣扇貝多肽混合物作用于HepG2細(xì)胞24 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)p53、Bcl-2蛋白表達(dá)情況如圖5所示。

圖5　海灣扇貝多肽混合物對(duì)HepG2細(xì)胞p53和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.5　Effect of bay scallop polypeptide mixture on p53 and Bcl-2 expression of HepG2 cells

由圖5可知，經(jīng)5 個(gè)不同質(zhì)量濃度（4、6、8、10、12 mg/mL）的海灣扇貝多肽混合物作用于體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，p53蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)則明顯降低，與對(duì)照組（0 mg/mL）相比有顯著差異（P＜0.05），且海灣扇貝多肽混合物的質(zhì)量濃度越高，蛋白表達(dá)的差異越大。12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組p53和Bcl-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為（6.40±0.27）%和（3.60±0.12）%，而對(duì)照組則分別為（1.80±0.29）% 和（12.60±0.55）%。

3　討 論

以往對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行體外抑瘤活性檢測(cè)的報(bào)道中，多采用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法，與MTT法相比，WST-8（CCK-8試劑中的有效成分）具有操作簡(jiǎn)化、結(jié)果更加穩(wěn)定、線性范圍更寬、靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)。為此，本實(shí)驗(yàn)選用CCK-8法檢測(cè)海灣扇貝多肽混合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度（4、6、8、10、12 mg/mL）的海灣扇貝多肽混合物在作用24 h后能極顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，隨著海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度的提高，抑制效果逐漸增強(qiáng)，12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組的效果最明顯。這提示海灣扇貝多肽混合物能夠抑制HepG2細(xì)胞增殖，具有抗腫瘤活性。

在正常生理或病理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞發(fā)生的一種自發(fā)性、程序性死亡過(guò)程。它與癌癥等許多疾病的發(fā)生有關(guān)。目前，許多抗腫瘤藥物作用的主要機(jī)制之一是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［14-17］。細(xì)胞凋亡首先表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)改變，凋亡細(xì)胞最典型的特征是細(xì)胞核形態(tài)變化，為此，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察成為判斷細(xì)胞凋亡最基本、最可靠的方法［18］。本實(shí)驗(yàn)以不同質(zhì)量濃度的海灣扇貝多肽混合物作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示，海灣扇貝多肽混合物處理24 h后，人肝癌HepG2細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，其中，12 mg/mL海灣扇貝多肽混合物處理組細(xì)胞出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，表明海灣扇貝多肽混合物能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。

在細(xì)胞凋亡研究中，流式細(xì)胞術(shù)是一種可靠的技術(shù)手段，能夠較準(zhǔn)確地測(cè)定出凋亡細(xì)胞占所測(cè)定總細(xì)胞的百分含量。本實(shí)驗(yàn)用AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡試劑盒經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度海灣扇貝多肽混合物處理組的HepG2細(xì)胞均出現(xiàn)一定程度的凋亡，且隨著海灣扇貝多肽混合物質(zhì)量濃度的增加，死亡或晚期凋亡率、早期凋亡率均明顯升高。這說(shuō)明海灣扇貝多肽混合物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡均有一定的誘導(dǎo)作用，且成劑量-效應(yīng)正相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體穩(wěn)定的重要保護(hù)機(jī)制，一旦細(xì)胞凋亡機(jī)能紊亂或降低時(shí)，腫瘤發(fā)生率就會(huì)增加［19］。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的發(fā)生受多個(gè)基因的調(diào)控，其中，Bcl-2家族調(diào)節(jié)的線粒體通路是目前研究較為透徹的一個(gè)。該家族可分為2 個(gè)亞群：其中一個(gè)亞群由Bax、Bik、Bak等促凋亡分子組成；另一個(gè)亞群由Bcl-2、Bcl-X、Bcl-W等抗凋亡蛋白組成。下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)或上調(diào)Bax蛋白表達(dá)可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，反之則抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控取決于自身表達(dá)水平的高低。因此，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平具有重要的生理意義［20-21］。

朱開(kāi)梅等［22-23］研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)樹(shù)葉總黃酮可通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，即下調(diào) Bcl-2/Bax，從而抑制HepG-2細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。孟顯峰等［24］研究發(fā)現(xiàn)，肌醇六磷酸可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡。呂必華等［25］研究發(fā)現(xiàn)，選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，活化Caspase-3通路，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡。另外，1979年被首次報(bào)道的p53也是重要的腫瘤抑制基因，是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因［26］。p53蛋白在腫瘤細(xì)胞由G1期到S期的轉(zhuǎn)變中起重要調(diào)控作用，p53蛋白過(guò)度表達(dá)能阻滯細(xì)胞周期，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過(guò)Caspases途徑最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，海灣扇貝多肽混合物作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后，p53蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低。

綜上所述，海灣扇貝多肽混合物對(duì)體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，可通過(guò)上調(diào)p53蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮其抑瘤作用。

［1］CHEN Haiying， CHU Xiao， YAN Chunling， et al. Polypeptide from Chlamys farreri attenuates murine thymocytes damage induced by ultraviolet B［J］. Acta Pharmacologica Sinica， 2007，28（10）： 1665-1670.

［2］LIU Xiaojin， WANG Wencheng， WANG Hongjiang， et al. A polypeptide from Chlamys farreri inhibits UVB-induced HaCaT cells apoptosis via the Apaf-1/caspase-9 and Smac/XIAP signaling pathway［J］. Chinese Journal of Oceanology and Limnology， 2009， 27：587-593.

［3］RAWAT D S， JOSHI M C， JOSHI P， et al. Marine peptides and related compounds in clinical trial［J］. Anti-cancer Agents in Medicinal Chemistry， 2006， 6（1）： 33-40.

［4］楊永芳， 郁迪， 閆海強(qiáng)， 等. 海洋貝類提取物抗腫瘤活性的研究進(jìn)展［J］.中藥材， 2011， 34（7）： 1152-1155.

［5］仲偉珍， 張健， 宋立萍， 等. 海洋貝類提取物的藥理作用研究［J］. 中國(guó)海洋藥物， 2004， 23（3）： 31-33.

［6］胡文琴， 王恬， 孟慶利. 抗氧化活性肽的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)油脂，2004， 29（5）： 42-45.

［7］劉媛， 王健， 牟建樓， 等. 扇貝貝肉抗氧化肽制備及體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（8）： 206-209.

［8］劉媛， 王健， 牟建樓， 等. 海灣扇貝多肽對(duì)小鼠H22肝癌移植瘤的抑制機(jī)制研究［J］. 現(xiàn)代食品科技， 2014， 30（12）： 1-6.

［9］陳燕， 薛大忠， 羅強(qiáng)， 等. COX-2選擇性抑制劑聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志， 2014，24（6）： 19-23.

［10］ 羅強(qiáng)， 孫黎， 田青青， 等. 剛地弓形蟲(chóng)速殖子培養(yǎng)上清液對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖和凋亡的影響［J］. 中國(guó)寄生蟲(chóng)與寄生蟲(chóng)病雜志，2014， 32（2）： 123-127.

［11］ 李海軍， 趙曉霞， 白美玲， 等. 苦參堿對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡及線粒體跨膜電位的影響［J］. 江蘇醫(yī)藥， 2011， 37（4）： 396-398.

［12］ 羅強(qiáng)， 孫黎， 張力， 等. 姜黃素對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡機(jī)制的影響［J］. 中國(guó)老年學(xué)雜志， 2011， 31（16）： 3108-3109.

［13］ 孫黎， 羅強(qiáng)， 張力， 等. 金蓮花黃酮對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志， 2011， 31（1）： 82-83.

［14］ JI Y B， GAO S Y， JI C F， et al. Induction of apoptosis in HepG2 cells by solanine and Bcl-2 protein［J］. Journal of Ethnopharmacology， 2008，115（2）： 194-202.

［15］ HASEGAWA M， YAGI K， IWAKAWA S， et al. Chitosan induces apoptosis via caspase-3 activation in bladder tumor cells［J］. Japanese Journal of Cancer Research， 2001， 92（4）： 459-466.

［16］ 董志峰， 程云， 歐陽(yáng)藩， 等. 海鞘中的抗腫瘤生物活性物質(zhì)［J］. 生物工程進(jìn)展， 1999， 19（2）： 32-34.

［17］ NEZHAT F， WADLER S， MUGGIA F， et al. Phase II trial of the combination of bryostatin-1 and cisplatin in advanced or recurrent carcinoma of the cervix： a New York gynecologic oncology group study［J］. Gynecologic Oncology， 2004， 93（1）： 144-148.

［18］ 宋瑩， 王建剛， 崔朝初， 等. 壁虎粗多肽誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的機(jī)制研究［J］. 中藥材， 2012， 35（6）： 863-866.

［19］ van GEELEN C M M， PENNARUN B， EK B V， et al. Downregulation of active caspase 8 as a mechanism of acquired TRAIL resistance in mismatch repair-profi cient colon carcinoma cell lines［J］. International Journal of Oncology， 2010， 37（4）： 1031-1041.

［20］ 王安紅， 盧國(guó)彥， 周昆， 等. 補(bǔ)骨脂乙素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡及對(duì)Bcl-2家族表達(dá)的影響中藥藥理與臨床［J］. 中藥藥理與臨床， 2012，28（5）： 23-25.

［21］ MIAO Ruidong， WEI Juan， Lü Minghua， et al. Conjugation of substituted ferrocenyl to thiadiazine as apoptosis-inducing agents targeting the Bax/Bcl-2 pathway［J］. European Journal of Medicinal Chemistry， 2011， 46（10）： 5000-5009.

［22］ 朱開(kāi)梅， 陳丹， 李美波， 等. 構(gòu)樹(shù)葉總黃酮調(diào)控Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)及caspase-3活性誘導(dǎo)HepG細(xì)胞凋亡的研究［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2014， 19（20）： 128-133.

［23］ 朱開(kāi)梅， 李美波， 駱彩珍， 等. 構(gòu)樹(shù)葉總黃酮提取物誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡及機(jī)制［J］. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2013， 33（21）：1763-1767.

［24］ 孟顯峰， 宋揚(yáng)， 楊偉品. IP6誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡及其對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)影響［J］. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 47（4）： 311-313.

［25］ 呂必華， 張玲， 劉靜. COX-2抑制劑NS-398對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2和Caspase 3表達(dá)的影響［J］. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2007，18（4）： 21-24.

［26］ 周愛(ài)儒， 查錫良. 生物化學(xué)［M］. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2000： 421.

［27］ KUO Yuchun， KUO Polin， HSU Yaling， et al. Ellipticine induces apoptosis through p53-dependent pathway in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells［J］. Life Sciences， 2006， 78（22）： 2550-2557.

Effect of Polypeptide Mixture from Bay Scallop on Proliferation and Apoptosis of HepG2 Cells

LIU Yuan1，2， WANG Jian2， MU Jianlou1， SUN Jianfeng1， WANG Jie1，*
（1. College of Food Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding071000， China；2. College of Agriculture and Forestry Science and Technology， Hebei North University， Zhangjiakou075000， China）

The antitumor effi cacy and mechanism of the polypeptide mixture from bay scallop were studied by CCK-8 assays using inverted microscope and fl uorescence-activated cell sorter （FACS）. The results showed that different concentrations of the polypeptide mixture from bay scallop （4， 6， 8， 10 and 12mg/mL） could suppress the growth of human hepatocellular carcinoma cells HepG2， and the growth inhibitory rate increased with increasing concentration of the polypeptide mixture. After treated with the polypeptide mixture at a dose of 12 mg/mL， the morphology of HepG2 cells was changed， showing cell shrinkage， decreased transparency and nuclear chromatin pyknosis as well as the appearance of apoptotic bodies. To conclude， the polypeptide mixture from bay scallop can induce apoptosis of HepG2 cells.

polypeptide from bay scallop； HepG2 cell； apoptosis

S986.1

A

1002-6630（2015）23-0257-05

10.7506/spkx1002-6630-201523047

2015-01-30

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201205031）；河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（14273205D-3）

劉媛（1981—），女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：liuyuanwenwen1981@126.com

王頡（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸づc利用。E-mail：wj591020@163.com