曾海娟，王廣彬，郭慧琴，邱　實(shí)，李建武，翟緒昭，丁承超，宋春美，劉　箐，*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上?！?00093；2.徐州綠健乳品飲料有限公司，江蘇 徐州　221006；3.上海慧耘生物科技有限公司，上?！?00433）

抗瓜類細(xì)菌性果斑病菌單克隆抗體的制備及特性鑒定

曾海娟1，王廣彬2，郭慧琴3，邱實(shí)1，李建武1，翟緒昭1，丁承超1，宋春美1，劉箐1，*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093；2.徐州綠健乳品飲料有限公司，江蘇 徐州221006；3.上海慧耘生物科技有限公司，上海200433）

以瓜類細(xì)菌性果斑病菌燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac）野生型菌株SD01免疫BALB/c小鼠，間接酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法篩選獲得4 株穩(wěn)定分泌抗SD01菌株的單克隆雜交瘤細(xì)胞株6F、6D、7E、4F，腹水抗體效價(jià)分別為1∶102 400、1∶102 400、1∶25 600、1∶51 200。采用飽和硫酸銨沉淀及Protein-G親和層析法純化腹水，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）顯示純化后的單克隆抗體（mAb）純度較高，純化后單克隆抗體（2 mg/mL）效價(jià)分別為1∶12 800、1∶6 400、1∶3 200、1∶6 400，亞型鑒定結(jié)果表明4 種單克隆抗體均為IgG2 a。間接ELISA結(jié)果表明，4 種單克隆抗體對(duì)8 種果斑病菌結(jié)合能力不同：6F可以結(jié)合6 種，6D、4F可以結(jié)合8 種，7E可以結(jié)合5 種。與3 種非Aac近源種植物病原菌交叉反應(yīng)情況為：6F、4F與2 種非Aac近源種植物病原菌存在交叉反應(yīng)，6D、7E與3 種非Aac近源種植物病原菌均無交叉反應(yīng)。

細(xì)菌性果斑病菌；單克隆抗體；制備；特性鑒定

瓜類細(xì)菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是一種嚴(yán)重的細(xì)菌性病害，可引起西瓜、甜瓜等多種葫蘆科植物患病。其病原體為燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac），又稱果斑病菌、西瓜斑菌，是一種具有極高破壞性的革蘭氏陰性種傳病菌。它可侵染果實(shí)、植株及種子，該病菌抗干旱能力非常強(qiáng)［1］，可在種子表面存活4～5 個(gè)月［2］。帶菌果實(shí)表面初期會(huì)出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，最終導(dǎo)致整個(gè)果實(shí)腐爛，所引起的病害具有發(fā)病快、傳播性強(qiáng)等特點(diǎn)，感染此病害會(huì)導(dǎo)致瓜類大量減產(chǎn)［3］。

果斑病菌快速檢測(cè)方法主要有基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的檢測(cè)方法和免疫學(xué)方法?；赑CR的檢測(cè)方法主要有巢式PCR（nested-PCR）［4］、免疫PCR［5-7］、實(shí)時(shí)熒光定量PCR［8-9］、等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)［10-11］等，該類方法具有靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但需要精密的熱循環(huán)儀器，對(duì)技術(shù)人員和設(shè)備也有一定的要求。免疫學(xué)方法是以抗體特異性識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)技術(shù)，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法及上述檢測(cè)方法相比，具有特異性強(qiáng)、快速、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于植物病原菌的檢測(cè)，已報(bào)道的可用于果斑病菌檢測(cè)的免疫學(xué)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）［12］、免疫磁珠技術(shù)［13］、免疫試紙條技術(shù)［14-15］、蛋白宏陣列［16］等。但免疫學(xué)技術(shù)的建立依賴于特異性的單克隆抗體，單克隆抗體專一性是免疫學(xué)檢測(cè)方法的重要因素，但基于細(xì)菌血清型復(fù)雜、近源種較多等原因，特異性抗體的獲取極為困難，因此特異性單克隆抗體是病原細(xì)菌免疫學(xué)檢測(cè)的重要瓶頸，本實(shí)驗(yàn)擬制備抗果斑病菌的單克隆抗體，并對(duì)抗體的特性（效價(jià)、純度、特異性）進(jìn)行鑒定，旨在為建立特異、快速、簡便的果斑病菌免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù)奠定基礎(chǔ)，關(guān)于該細(xì)菌單克隆抗體目前尚未見國內(nèi)外報(bào)道。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1菌株與培養(yǎng)基

Aac標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29625，Aac野生菌株SD01、99-5、xj112、PLSB1、00-1、plsb91、tw31由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院從國內(nèi)外瓜類產(chǎn)品中截獲后分離所得，已進(jìn)行了分離鑒定、柯赫氏法則等的驗(yàn)證；燕麥?zhǔn)人峋ㄌ厝R蘭亞種NCPPB 961、嗜酸菌魔芋亞種ATCC 33996、玉米細(xì)菌性條斑菌ATCC 19307，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫所提供。

金氏B培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.2細(xì)胞與動(dòng)物

骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為上海理工大學(xué)有害微生物危害與控制研究所保存。

6～8 周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠（體質(zhì)量約20 g），購自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.3試劑

液體石蠟、8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，8-AG）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、50×HAT（次黃嘌呤（hypoxanthine）、氨喋呤（aminopterin）、胸腺嘧啶核苷（thymidine））、50×HT（次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷）、辣根過氧化物酶（horse reddish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體美國Sigma公司；Taq DNA聚合酶及其他PCR試劑生工生物工程（上海）股份有限公司；本實(shí)驗(yàn)所用引物根據(jù)Walcott等［17］報(bào)道，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其核苷酸序列為：WFB1：GACCAGCCACACTGGGAC，WFB2：CTGCCGTACTCCAGCGAT；Biosun胎牛血清上海博升生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基美國Invitrogen公司；單克隆抗體亞型鑒定二抗洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；Protein G親和層析柱美國GE Healthcare公司；25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板無錫耐思生物科技有限公司；其余常規(guī)試劑均為分析純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4儀器與設(shè)備

PCR熱循環(huán)儀美國Applied Biosystems公司；凝膠成像儀英國Syngene公司；Mini-power電泳儀、蛋白提純儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀美國伯樂公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀美國分子儀器公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱美國Thermo公司。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定及細(xì)菌培養(yǎng)基選擇

8 種果斑病菌菌株先在腦心浸液液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，后在其固體培養(yǎng)基劃線，挑單菌落于腦心浸液培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，并測(cè)定其在600 nm波長處的光密度（OD）值，選取生長較快的一株菌株作為免疫菌株。挑取該菌株的單菌落分別于腦心浸液液體培養(yǎng)基及金氏B液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18 h后，采用梯度稀釋涂平板計(jì)數(shù)，比較該菌株在2 種培養(yǎng)基中生長快慢程度。

1.2.2Aac免疫小鼠方法

選擇效果好的培養(yǎng)基進(jìn)行SD01單菌落接菌，滅菌生理鹽水離心重懸3 次，并調(diào)整菌濃度為108CFU/mL，免疫方案如表1所示。第4次免疫后第7天斷尾采血，分離血清，采用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。間接ELISA條件如下：甲醛滅活的全菌抗原的包被濃度為108CFU/mL，37 ℃包被2 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的脫脂奶粉封閉1.5 h，血清100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST（phosphate buffered saline（磷酸鹽緩沖液）+ Tween-20）洗滌3 次，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)1 h后PBST洗滌3 次，四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色液顯色15 min，2 mol/L濃H2SO4終止反應(yīng)，450 nm波長處測(cè)定OD值。以實(shí)驗(yàn)組OD450nm/陰性對(duì)照組OD450nm（P/N）≥2.1判定為陽性，以血清最大稀釋倍數(shù)的陽性孔作為該小鼠血清效價(jià)。取血清效價(jià)最高小鼠的脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合，融合前72 h進(jìn)行小鼠腹腔沖擊免疫，抗原劑量為0.6 mL/只。

表1　小鼠免疫程序Table 1 Immunization schedule

1.2.3細(xì)胞融合及篩選

摘眼球取血后，脊椎脫臼處死小鼠取脾臟，用注射器研磨獲得脾細(xì)胞懸液，與SP2/0細(xì)胞分別用無血清培養(yǎng)基離心重懸3 次，并經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按數(shù)量比5∶1混合后離心去上清液，以體積分?jǐn)?shù)50%的PEG進(jìn)行融合，含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止融合，按105個(gè)/孔鋪于已鋪飼養(yǎng)層細(xì)胞的96 孔板中。雜交瘤細(xì)胞采用HAT培養(yǎng)基篩選，待細(xì)胞鋪滿孔底70%～80%時(shí)，取上清液，采用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，以未處理的小鼠血清作為陰性對(duì)照。陽性孔細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行克隆化，亞克隆過程改用HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，間接ELISA法篩選，每次克隆篩選到的陽性孔擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存于液氮中。

1.2.4腹水制備及抗體效價(jià)測(cè)定

采用體內(nèi)誘生法制備腹水［18］。將液體石蠟按0.5 mL/只腹腔注射致敏小鼠，7 d后雜交瘤細(xì)胞按106個(gè)/只腹腔注射已致敏小鼠，待小鼠腹腔膨大、精神不佳后無菌收集腹水，離心取上清液，倍比稀釋，間接ELISA法測(cè)定腹水抗體效價(jià)，以腹水抗體最大稀釋倍數(shù)的陽性孔作為該抗體效價(jià)。

1.2.5抗體純化及純度測(cè)定

單克隆抗體腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀初步純化后，再經(jīng)Protein-G柱親和層析純化。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定純化后抗體的純度，參照文獻(xiàn)［19］原理進(jìn)行，樣品于100 ℃條件下干浴5 min，加樣量為20 μg，考馬斯亮藍(lán)R250染色，以脫色液進(jìn)行脫色。

1.2.6純化后抗體效價(jià)及亞型鑒定

亞型鑒定采用間接ELISA法，按照小鼠單克隆抗體亞型分類試劑盒（IgG1、IgG2 a、IgG2 b、IgG3、IgA、IgM）說明書方法進(jìn)行，2 mg/mL單克隆抗體均稀釋1 000 倍，亞型鑒定羊抗鼠IgG抗體稀釋1 000 倍。效價(jià)測(cè)定采用間接ELISA法，P/N≥2.1的抗體最大稀釋倍數(shù)為該單克隆抗體的效價(jià)。

1.2.7抗體特異性分析

間接ELISA法測(cè)定抗體對(duì)8 種果斑病菌及3 種非Aac植物病原菌結(jié)合情況，以108CFU/mL的上述11 種菌包被酶標(biāo)板，2 mg/mL單克隆抗體均稀釋1 000 倍，測(cè)定在450 nm波長處的OD值。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR鑒定結(jié)果

圖1　8 種果斑病菌的PCR鑒定結(jié)果Fig.1　PCR identification of Aac

由圖1可知，8 種果斑病菌在360 bp處均出現(xiàn)亮條帶，表明這8 種細(xì)菌均為Aac。另外，條帶的亮度可能與基因表達(dá)量有關(guān)［20］。

2.28 種菌生長快慢程度及培養(yǎng)基選擇結(jié)果

圖2　8 種果斑病菌生長快慢比較Fig.2　Comparison of the growth speeds of bacterial fruit blotch

圖3　菌株SD01在兩種培養(yǎng)基中的生長效果Fig.3　Comparison of the growth of strain SD01 in two media

分別挑取8 種果斑病菌的單菌落于腦心浸液液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)相同時(shí)間后測(cè)定其在600 nm波長處的OD值。由圖2可知，8 種Aac菌株在腦心浸液液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18 h后，菌株SD01的OD600nm值最高，表明其生長速率最快，因此選擇此菌株作為免疫菌株。挑取菌株SD01的單菌落于腦心浸液液體培養(yǎng)基和金氏B液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)相同時(shí)間，分別將菌液依次10 倍稀釋至稀釋度為10-6，涂平板計(jì)數(shù)，由圖3可知，菌株SD01在兩種培養(yǎng)基中生長速率差異較大，在腦心浸液培養(yǎng)基中生長較快，計(jì)數(shù)后得出其在兩種培養(yǎng)基中的菌體濃度分別為1.3×109、4.1×108CFU/mL。

2.3小鼠血清效價(jià)

將3 只小鼠血清分別稀釋1 000、5 000、10 000、50 000 倍，血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果如表2所示。1、2、3號(hào)小鼠血清效價(jià)分別可達(dá)到1∶10 000，1∶50 000，1∶5 000。2號(hào)小鼠血清稀釋50 000 倍時(shí)，P/N為3.7，效價(jià)最高，因此選擇2號(hào)小鼠加強(qiáng)免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合。

表2　小鼠血清效價(jià)比較（P//NN）Table 2　Comparison of serum titers of mice （P/N）

2.4單克隆抗體篩選

在兩種細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中，共鋪8 塊96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，其中701 個(gè)孔有雜交瘤細(xì)胞生長，雜交瘤融合率為91.3%，經(jīng)間接ELISA法篩選，得到4 孔具有特異性抗菌株SD01的雜交瘤細(xì)胞。在克隆化過程中有3 株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3 次亞克隆后陽性克隆率為100%，命名為6F、6D、7E；有1 株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)4 次亞克隆后陽性克隆率達(dá)100%，命名為4F。4 株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)多次傳代、反復(fù)凍存及復(fù)蘇后，抗體分泌能力穩(wěn)定。

2.5腹水制備及純化后抗體效價(jià)及亞型測(cè)定結(jié)果

間接ELISA測(cè)定4 株雜交瘤細(xì)胞株6F、6D、7E、4F的腹水抗體效價(jià)，陰性對(duì)照為未免疫的小鼠血清，對(duì)照值（N）為0.11。如圖4a所示，雜交瘤細(xì)胞株6F、6D、7E、4F的腹水抗體效價(jià)分別為1∶102 400、1∶102 400、1∶25 600、1∶51 200。純化后的抗體（2 mg/mL）效價(jià)如圖4b所示，陰性對(duì)照為小鼠血清，對(duì)照值（N）為0.15，純化后抗體效價(jià)分別為1∶12 800、1∶6 400、1∶3 200、1∶6 400，抗體亞型均為IgG2 a。

圖4　腹水抗體及純化后抗體的效價(jià)Fig.4　Titers of ascites and purified antibodies

2.6純化單克隆抗體的SDS-PAGE分析

圖5　純化單克隆抗體的SDS-PAGGEE圖Fig.5　SDS-PAGE of purified monoclonal antibodies

由圖5可知，經(jīng)硫酸銨沉淀及Protein-G柱親和層析純化后的4 株單克隆抗體分別都有一條約50 kD的重鏈、一條約25 kD的輕鏈，無多余的雜條帶，表明腹水抗體中雜蛋白已經(jīng)被除去，純化后的抗體純度較高。

2.7抗體的特異性

間接ELISA檢測(cè)4 種單克隆抗體對(duì)8 種果斑病菌結(jié)合情況：6F可以結(jié)合6 種果斑病菌，與00-1、tw31不結(jié)合，6D可以與8 種果斑病菌結(jié)合，7E可以結(jié)合5 種果斑病菌，與00-1、tw31、ATCC 29625不結(jié)合，4F可以結(jié)合8 種果斑病菌。與3 種非Aac近源植物病原菌交叉反應(yīng)情況：6F與NCPPB 961、ATCC 33996有交叉反應(yīng)，6D、7E與這3 種非Aac近源植物病原菌均無交叉反應(yīng)，4F與ATCC 33996、ATCC 19307存在交叉反應(yīng)，具體結(jié)果見表3。

表3　4 種單克隆抗體的特異性分析Table 3　Specificity of monoclonal antibodies

3　討 論

本實(shí)驗(yàn)在選擇免疫菌株時(shí)，采用檢測(cè)OD600nm值進(jìn)行菌株生長快慢的比較，而在選擇培養(yǎng)基時(shí)，采用涂布平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌株生長快慢的比較，這是由于金氏B液體培養(yǎng)基本身就是混濁的，不能通過比較混濁度（OD600nm）來判定細(xì)菌濃度的大小。選取了兩種液體培養(yǎng)基：腦心浸液培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基，前者營養(yǎng)成分較好，適用于營養(yǎng)苛求菌的培養(yǎng)；而金氏B培養(yǎng)基是果斑病菌國標(biāo)上選用的培養(yǎng)基，因此本實(shí)驗(yàn)比較了菌株SD01在這兩種培養(yǎng)基上生長的快慢。比較菌株生長快慢的目的是細(xì)菌只有在最適培養(yǎng)條件下，才會(huì)完全、充分地表達(dá)抗原，同時(shí)可縮短間接ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)間，較快地得到檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)而可以較早處理陽性克隆孔。免疫小鼠時(shí)采用甲醛滅活的野生菌株SD01，免疫過程中未使用佐劑，由于全菌抗原比較完整，使免疫后獲得了較高的血清效價(jià)。

SP2/0細(xì)胞融合前先經(jīng)小鼠腹腔復(fù)壯，再采用8-AG培養(yǎng)基培養(yǎng)3 代以上。克隆化過程中，第1次亞克隆按2～3 個(gè)細(xì)胞/孔鋪板，第2次、第3次亞克隆均按1 個(gè)細(xì)胞/孔鋪板，鋪板3～4 d后觀察并記錄每孔實(shí)際細(xì)胞生長的克隆數(shù)，發(fā)現(xiàn)96 孔板最外圍孔內(nèi)的細(xì)胞狀態(tài)較差，可能是由于從培養(yǎng)箱取出96 孔板進(jìn)行計(jì)數(shù)的過程中，外圍孔溫度波動(dòng)較大，也表明了在雜交瘤細(xì)胞生長過程中保持穩(wěn)定的培養(yǎng)溫度及CO2濃度等的重要性。在獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞株后，可以采用體外培養(yǎng)法和體內(nèi)誘生法生產(chǎn)單克隆抗體，本實(shí)驗(yàn)采用體內(nèi)誘生法生產(chǎn)腹水，因?yàn)檫\(yùn)用此法獲得的腹水中抗體濃度較高，生產(chǎn)成本低。

據(jù)報(bào)道，采用硫酸銨沉淀純化腹水時(shí)［21］純度為25%，回收率為63%，純度較低，只能作為初步純化手段，本實(shí)驗(yàn)純化腹水采用飽和硫酸銨沉淀后又經(jīng)Protein-G柱親和層析純化，SDS-PAGE顯示純化后單克隆抗體純度較高。實(shí)驗(yàn)中的8 種果斑病菌菌株均來源于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，是從國內(nèi)外瓜類產(chǎn)品中截獲分離后得到的，也是目前國內(nèi)僅有的果斑菌菌株，基本可以代表已報(bào)道的菌株類型和血清型，更多的果斑菌菌株目前還難以獲取。目前，非Aac近源菌感染西瓜等瓜類種子或植株的情況尚未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)在抗體特異性鑒定時(shí)考察了8 種果斑病菌和3 種非Aac近源菌的結(jié)合情況。

本研究所獲得的4 株單克隆抗體，為開發(fā)檢測(cè)果斑病菌試劑盒提供了前提條件，也可進(jìn)一步用于建立果斑病菌的免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)，如ELISA檢測(cè)方法、免疫層析試紙技術(shù)、等離子體共振技術(shù)等，并可與其他植物病原菌抗體配合，建立植物病菌的多通道檢測(cè)方法，如蛋白芯片等。對(duì)多種檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)估，并根據(jù)檢測(cè)需要選擇適合的檢測(cè)方法，以達(dá)到高靈敏度、操作簡便、高通量的檢測(cè)目的。

［1］BLOCK C C， SHEPHERD L M. Long-term survival and seed transmission of Acidovorax avenae subsp. citrulli in melon and watermelon seed［J］. Phytopathology， 2009， 99（6）. doi： 10.1094/PHP-2008-1219-01-BR.

［2］李艷嫦， 孔靜月， 吳九玲， 等. 西瓜細(xì)菌性果斑病菌在不同場(chǎng)所存活期的檢測(cè)［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 31（3）： 332-336.

［3］DUTTA B. Localization of Acidovorax citrulli in watermelon seed and its influence on survival and seedling transmission of bacterial fruit blotch of cucurbits［D］. Athens： University of Georgia， 2011： 1-17.

［4］王婧， 畢陽， 朱艷， 等. 巢式PCR快速檢測(cè)西瓜細(xì)菌性果斑病菌［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 47（2）： 284-291.

［5］WANG Xiao， ZHANG Le， XU Fushou， et al. Immuno-capture PCR method for detecting Acidovorax avenae subsp. citrulli from watermelon［J］. Chinese Journal of Agricultural Biotechnology， 2007，4（2）： 173-179.

［6］徐福壽， 王笑， 謝關(guān)林， 等. 免疫捕捉PCR法檢測(cè)西瓜種子帶細(xì)菌性果斑病菌［J］. 果樹學(xué)報(bào)， 2008， 25（2）： 215-218.

［7］BAHAR O， EFRAT M， HADAR E， et al. New subspecies-specific polymerase chain reaction-based assay for the detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli［J］. Plant Pathology， 2008， 57（4）： 754-763.

［8］ZHAO T， FENG J J， SECHLER A， et al. An improved assay for detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in watermelon and melon seed［J］. Seed Science and Technology， 2009， 37（2）： 337-349.

［9］HA Y， FESSEHAIE A， LING K S， et al. Simultaneous detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli and Didymella bryoniae in cucurbit seedlots using magnetic capture hybridization and real-time polymerase chain reaction［J］. Phytopathology， 2009， 99（6）： 666-678.

［10］ OYA H， NAKAGAWA H， SAITO N， et al. Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli from seed using LAMP metho d［J］. Japanese Journal of Phytopathology， 2008， 74（4）： 304-310.

［11］ ZHANG J， TIAN Q， ZHU S， et al. Rapid on-site detection of Acidovorax citrulli by cross-priming amplifi cation［J］. Molecular and Cellular Probes， 2012， 26（4）： 175-176.

［12］ IMANANTO O， THUMMABENJAPONE P， LUXANANIL P， et al. Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in plant samples using enzyme-linked immunosorbent assay［J］. Journal of International Society for Southeast Asian Agricultural Sciences， 2009， 15（1）： 160-161.

［13］ CHARLERMROJ R， HIMANANTO O， SEEPIBAN C， et al. Multiplex detection of plant pathogens using a microsphere immunoassay technology［J］. PLoS ONE， 2013， 8（4）： e62344. doi：10.1371/journal.pone.0062344.

［14］ 馮建軍， 許勇， 李健強(qiáng). 免疫凝聚試紙條和TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)西瓜細(xì)菌性果斑病菌比較研究［J］. 植物病理學(xué)報(bào)， 2006，36（2）： 102-108.

［15］ 粟寒， 吳翠萍， 李彬， 等. 免疫檢測(cè)試紙條法檢測(cè)西瓜子中的瓜類果斑病菌［J］. 植物檢疫， 2009， 23（1）： 12-13.

［16］ 熊亮斌， 高麗萍， 劉箐， 等. 應(yīng)用蛋白宏陣列快速檢測(cè)西瓜細(xì)菌性果斑病菌［J］. 植物病理學(xué)報(bào)， 2011， 41（4）： 432-436.

［17］ WALCOTT R R， GITAITIS R D. Detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli in watermelon seed using immunomagnetic separation and the polymerase chain reaction［J］. Plant Disease， 2000， 84（4）： 470-474.

［18］ 孫廣瑞， 李小兵， 王哲. 制備分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞小鼠腹水的方法［J］. 中國現(xiàn)代醫(yī)生， 2007， 45（5）： 3-4.

［19］ 薩姆布魯克J， 弗里奇E F， 曼尼阿蒂斯T， 等. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.金冬雁， 黎孟楓， 侯云德， 等譯. 2版. 北京： 科學(xué)出版社， 1992：1713-1720.

［20］ 王釗， 儲(chǔ)麗紅， 趙凱， 等. 利用免疫磁性分離-PCR檢測(cè)安祖花細(xì)菌性枯萎病病原菌［J］. 園藝學(xué)報(bào)， 2013， 40（8）： 1600-1608.

［21］ 肖增鴻， 黃昭亮， 林月霞， 等. 腹水型單克隆抗體純化方法的研究［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2013（8）： 425-428.

Preparation and Characterization of Monoclonal Antibody against Acidovorax avenae subsp. citrulli in Melons

ZENG Haijuan1， WANG Guangbin2， GUO Huiqin3， QIU Shi1， LI Jianwu1， ZHAI Xuzhao1， DING Chengchao1， SONG Chunmei1， LIU Qing1，*
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai200093， China；2. Xuzhou Lüjian-Dairy Beverage Co. Ltd.， Xuzhou221006， China；3. Shanghai Prajna Biology Technique Ltd.， Shanghai200433， China）

Four hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies （mAbs） against SD01， namely 6F， 6D， 7E and 4F，were generated by immunizing BALB/c mice using wild-type strain SD01 of Acidovorax avenae subsp. citrulli （Aac） as the immunogen. Ascites antibody titers were 1：102 400， 1：102 400， 1：25 600， and 1：51 200，respectively. Ascites were purifi ed using saturated ammonium sulfate precipitation and Protein-G affi nity chromatography. Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis （SDS-PAGE） analysis showed high antibody purity. The titers of purified mAbs（2 mg/mL） were 1：12 800， 1：6 400， 1：3 200， and 1：6 400， respectively. The subclass of mAbs was IgG2 a. Indirect enzymelinked immunosorbent assay （ELISA） showed that four hybridoma cell lines had different binding capacity to eight strains of Aac and three species of non-Aac plant pathogens. 6F could bind six strains of Aac， 6D and 4F could bind eight strains of Aac， 7E could bind five strains of Aac. 6F and 4F had cross-reaction with two of the three species of non-Aac plant pathogens， and 6D and 7E had no cross-reaction with all the three species of non-Aac plant pathogens.

bacterial fruit blotch； monoclonal antibody； preparation； characterization

TS207.4

A

1002-6630（2015）23-0228-05

10.7506/spkx1002-6630-201523042

2015-01-29

上海市科委高校能力建設(shè)項(xiàng)目（13430502400）；“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”長三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項(xiàng)目（15395810900）；上海市研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目

曾海娟（1990—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)技術(shù)。E-mail：zenghaijuan12@126.com

劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理及快速檢測(cè)技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn