王慕華，潘佩平，趙玉明，2，蘇檳楠，蔡穎慧，李海濤，2

（1.山西省生物研究所，山西 太原　030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西 太原　030006）

保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體制備及融合

王慕華1，潘佩平1，趙玉明1，2，蘇檳楠1，蔡穎慧1，李海濤1，2

（1.山西省生物研究所，山西 太原030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西 太原030006）

為獲得具有抗噬菌體功能且發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌融合子，采用單親滅活及正交分析方法，研究了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌 體菌株的原生質(zhì)體制備及融合條件。結(jié)果表明：保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體制備的最適條件是以磷酸鹽緩沖液和甘露醇制作的高滲溶液為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，1.0 mg/mL的溶菌酶36 ℃處理30 min，原生質(zhì)體的形成率為（89.02±2.31）%，再生率為（4.62±0.22）%。嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質(zhì)體制備的最適條件是以Tris-HCl和蔗糖制作的高滲溶液為原生質(zhì)體穩(wěn)定劑，0.1 mg/mL的溶菌酶42 ℃處理30 min，原生質(zhì)體的形成率為（99.15±0.23）%，再生率為（5.79±0.17）%。單親滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質(zhì)體融合的最適條件為聚乙二醇6000（質(zhì)量濃度為400 g/L，添加0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2）40 ℃促融2 min，融合率可達（1.85±0.12）×10-6。所得融合子各項性能優(yōu)良，適合于酸奶生產(chǎn)。

保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株；原生質(zhì)體制備；原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合因其具有重組頻率高［1］、遺傳穩(wěn)定、可實現(xiàn)遠緣雜交［2］、可集合雙親優(yōu)良性狀等優(yōu)點，在微生物育種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［3-5］。保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌作為酸奶生產(chǎn)的主要菌株，通常認為二者具有互惠共生關(guān)系［6］，在牛奶發(fā)酵過程中協(xié)同作用，使得牛乳凝固時間縮短，產(chǎn)品黏度增加，產(chǎn)品風(fēng)味增強［7-8］。近年來也有學(xué)者認為某些嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌之間也存在拮抗抑制作用［9］，混合發(fā)酵時菌體量的比例不合適或條件控制不當(dāng)就會直接影響到酸奶的生產(chǎn)時間與品質(zhì)。同時，噬菌體污染一直是困擾乳品發(fā)酵業(yè)的一大難題，為酸奶發(fā)酵選育出既具有抗噬菌體功能又具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的菌株，成為乳制品企業(yè)目前亟待解決的問題［10-12］。

本實驗從生產(chǎn)實際出發(fā)，研究了保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體制備與再生條件，以及二者的融合條件與融合子的篩選。得到的融合子一方面保持了嗜熱鏈球菌的噬菌體抗性，另一方面又結(jié)合了保加利亞乳桿菌的優(yōu)良性狀且融合子易于培養(yǎng)，有望實現(xiàn)酸奶發(fā)酵時單一菌株發(fā)酵，為酸奶發(fā)酵菌株的選育提供一條新途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株（Streptococcus thermophilus，S. t）由山西省生物研究所選育、保藏。

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，L. b）由山西維爾生物乳制品有限公司提供，山西省生物研究所保藏。

噬菌體：3 種噬菌體混合液，由山西省生物研究所分離、保藏。

1.1.2溶液與試劑

高滲溶液Ⅰ［13］：0.5 mol/L蔗糖溶液中加入0.02 mol/L順丁烯二酸，調(diào)整pH值為6.5，再加入0.02 mol/L MgCl2。

高滲溶液Ⅱ［14-15］：10 mmol/L Tris-HCl中加入0.5 mol/L蔗糖和0.02 mol/L MgCl2，用4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5。

高滲溶液Ⅲ［16］：0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（265 mL 0.2 mol/L Na2HPO4+735 mL 0.2 mol/L NaH2PO4，pH 6.4）中加入0.8 mol/L甘露醇。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000：高滲溶液配制為400 g/L，并向其中加入0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2。

溶菌酶液：高滲溶液配制為10 mg/mL的酶原液，現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾除菌。

溶菌酶（22 800 U/mg）美國BBI公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基［17］：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 l mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，固體培養(yǎng)基添加15 g的瓊脂，用于保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)。

M17培養(yǎng)基［17］：植質(zhì)蛋白胨5.0 g、聚蛋白胨5.0 g、酵母提取物5.0 g、牛肉浸膏2.5 g、抗壞血酸0.5 g、β-甘油磷酸二鈉19.0 g、1.0 mol/L MgSO4·7H2O 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8，固體培養(yǎng)基添加15 g的瓊脂，用于嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養(yǎng)。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基［13］：MRS、M17再生培養(yǎng)基為在其原有配方的基礎(chǔ)上添加0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L MgCl2。

脫脂乳培養(yǎng)基：牛乳脫脂后115 ℃滅菌15 min，冷卻后置于冰箱冷藏備用，用于菌種的活化和菌株發(fā)酵性能的研究。

1.2儀器與設(shè)備

PHS-3C雷磁pH計上海精密科學(xué)儀器有限公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計上海天平儀器廠；SLJ-Ⅰ型離心機沈陽理化儀器廠；722PC可見分光光度計上海佑科儀器儀表有限公司；WS2-134-75電熱恒溫培養(yǎng)箱連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器廠；JT-型超凈工作臺常州第二航海儀器廠。

1.3方法

1.3.1指標測定方法

噬菌體效價：采用雙層瓊脂平板法［18］測定；酸奶中酸度：按GB 5409—85《牛乳檢驗方法》中滴定法測定；pH值：采用雷磁PHS-3C精密酸度計于室溫測定；黏度：采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計，取牛乳發(fā)酵后冷藏過夜的樣品進行測定。

1.3.2保加利亞乳桿菌L. b及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t的培養(yǎng)

1.3.2.1菌體活化培養(yǎng)

將菌株從保存管中取出，以3%的接種量接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，菌株S. t 42 ℃培養(yǎng)4～6 h，菌株L. b 40 ℃培養(yǎng)10～12 h，連續(xù)活化2 代。

1.3.2.2菌體生長曲線的測定

菌種活化后，將菌株S. t接入M17液體培養(yǎng)基中，42 ℃培養(yǎng)24 h；將菌株L. b接入MRS液體培養(yǎng)基中，40 ℃培養(yǎng)24 h。每隔2 h取樣，稀釋后涂平板、計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標，相應(yīng)的活菌體數(shù)為縱坐標，繪制生長量變化曲線。

1.3.3原生質(zhì)體的制備及再生［19］

影響原生質(zhì)體制備及再生的因素除菌體菌齡及合適的酶系外［20］，還與維持原生質(zhì)體穩(wěn)定的高滲溶液、酶質(zhì)量濃度、酶解溫度、酶解時間等有關(guān)［16］，在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體制備中采用溶菌酶作為去璧酶系，設(shè)計正交試驗確定其他酶解條件。

取菌株L. b和菌株S. t對數(shù)生長期的培養(yǎng)菌液15 mL，4 000 r/min離心10 min，去上清液。用5 mL高滲溶液反復(fù)洗滌兩次，去上清液。最后用15 mL高滲溶液懸浮即得菌體懸浮液，調(diào)整菌體濃度為109CFU/mL，分別取1 mL稀釋后涂MRS、M17平板，計數(shù)。另取1 mL調(diào)整好的菌體懸浮液，加入終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/mL的溶菌酶，于30、36、42 ℃恒溫酶解30、40、50 min。酶解后的菌液用高滲溶液洗滌兩次，用1 mL高滲溶液懸浮得到原生質(zhì)體液。將菌株L. b的原生質(zhì)體液用高滲溶液適當(dāng)稀釋后分別涂布于MRS及MRS再生培養(yǎng)基，40 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。將菌株S. t的原生質(zhì)體液用高滲溶液適當(dāng)稀釋后分別涂布于M17及M17再生培養(yǎng)基，42 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，測定菌株L. b和菌株S. t原生質(zhì)體的形成率和再生率。

式中：A為酶解前的總菌落數(shù)/（CFU/mL），通過菌體懸浮液涂皿計數(shù)所得；B為未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)/（CFU/mL），通過原生質(zhì)體液涂皿計數(shù)所得；C為酶解后的再生菌菌落數(shù)/（CFU/mL），通過原生質(zhì)體液涂再生培養(yǎng)基平皿計數(shù)所得。

1.3.4保加利亞乳桿菌L. b的原生質(zhì)體滅活［21］

取菌株L. b對數(shù)生長期MRS培養(yǎng)菌液30 mL，4 000 r/min離心10 min，去上清液。用10 mL高滲溶液反復(fù)洗滌兩次，去上清液。最后用30 mL高滲溶液懸浮，在合適條件下溶菌酶酶解，進行原生質(zhì)體制備。酶解結(jié)束后將原生質(zhì)體液適當(dāng)稀釋，涂MRS再生培養(yǎng)基平皿，40 ℃培養(yǎng)3～5 d后計數(shù)。同時將原生質(zhì)體液分為3 份，每份8 mL，分別于60、70、80 ℃進行原生質(zhì)體滅活。每隔10 min取樣，顯微鏡觀察原生質(zhì)體形態(tài)并適當(dāng)稀釋后涂MRS再生培養(yǎng)基平皿，40 ℃培養(yǎng)3～5 d后計數(shù)。

式中：A1為滅活前長出的菌落數(shù)/（CFU/mL）；A2為滅活后長出的菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5保加利亞乳桿菌L. b和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t的原生質(zhì)體融合

1.3.5.1原生質(zhì)體的融合

取等量的菌株L. b原生質(zhì)體滅活液和菌株S. t原生質(zhì)體液混合，取樣分別涂M17、M17再生平皿，混合后放置5 min，2 500 r/min離心10 min，收集原生質(zhì)體，于沉淀中加入0.2 mL高滲溶液充分懸浮，再加入1.8 mL PEG 6000溶液，混勻后分別于30、35、40、45 ℃處理2、5、10 min，2 500 r/min離心10 min后，除去上清，沉淀懸浮于2 mL高滲溶液中，將懸浮液適當(dāng)稀釋后涂MRS再生平皿。M17平皿42 ℃，培養(yǎng)48 h后計數(shù)；M17、MRS再生平皿42 ℃，培養(yǎng)3～5 d后計數(shù)。

1.3.5.2融合子的篩選

菌株L. b可以在MRS、M17培養(yǎng)基上生長且對本實驗用到的噬菌體敏感，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t在MRS培養(yǎng)基上非厭氧培養(yǎng)時不生長。融合前將菌株L. b的原生質(zhì)體進行滅活，對融合后得到的在MRS培養(yǎng)基生長的菌株進行噬菌體抗性檢測，能在MRS培養(yǎng)基上生長且具有噬菌體抗性的菌株即為融合子。

式中：D為融合子數(shù)；E為融合前在M17再生培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)/（CFU/mL）；F為融合前在M17培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5.3融合子的穩(wěn)定性實驗

將獲得的融合子以3%接種量與1%噬菌體（109PFU/mL）在牛乳培養(yǎng)基中共同傳代15 代，取第5、10、15代適當(dāng)稀釋后涂MRS培養(yǎng)基平皿普通培養(yǎng)，計算活菌數(shù)并在傳代后觀察融合子的菌體形態(tài)，測定融合子的穩(wěn)定性。

1.3.5.4融合子的發(fā)酵特性

將所獲得的融合子以3%的接種量接入150 mL滅菌牛乳中，42 ℃培養(yǎng)，每隔2 h測定其活菌數(shù)及pH值。以菌株L. b、S. t及L. b與S. t混合發(fā)酵為對照，發(fā)酵結(jié)束后，統(tǒng)計融合子的凝乳時間、黏度及滴定酸度。

2　結(jié)果與分析

2.1菌體生長情況

圖1　菌株生長曲線Fig.1　Growth curves of L. bulgaricus and S. thermophilus

對菌株S. t和L. b的菌體生長情況進行測定，其生長曲線如圖1所示，菌株S. t和L. b均為培養(yǎng)5 h后進入對數(shù)生長期。菌株S. t培養(yǎng)12 h后進入對數(shù)生長后期，14～16 h達到穩(wěn)定期；菌株L. b培養(yǎng)14 h后進入對數(shù)生長后期，16～18 h達到穩(wěn)定期。一般原生質(zhì)體制備時選用對數(shù)生長早、中期的細胞，此時細胞壁對酶解敏感，原生質(zhì)體形成率高［22］，因而選用培養(yǎng)10 h的菌株S. t、培養(yǎng)12 h的菌株L. b用于原生質(zhì)體的制備。

2.2保加利亞乳桿菌L. b的原生質(zhì)體制備及再生

2.2.1最佳原生質(zhì)體制備條件的確定

通過正交試驗確定菌株L. b的最佳酶解條件，每個試驗號重復(fù)3 次，其正交試驗方案及結(jié)果見表1。影響菌株L. b原生質(zhì)體形成的主要因素為溶菌酶的質(zhì)量濃度，其次為酶解溫度，原生質(zhì)體穩(wěn)定液和酶解時間影響不是很大。從正交表得出的最佳酶解條件為：A2B3C2D2，即原生質(zhì)體穩(wěn)定液選擇高滲溶液Ⅱ、酶質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、酶解溫度為36 ℃、酶解時間為40 min，在此條件下進行菌株L. b的原生質(zhì)體制備，原生質(zhì)體形成率為（91.50±2.62）%。

表1　菌株L. b原生質(zhì)體制備條件的正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design with experimental results on protoplast formation of L. bulgaricus

2.2.2原生質(zhì)體形成率與再生率的關(guān)系

由表1可知，原生質(zhì)體的形成率與再生率并不成正比，3號原生質(zhì)體的形成率比較高，而再生率低，究其原因可能是因為3號原生質(zhì)體制備時酶解溫度比較高、酶解時間比較長，這些雖然有利于原生質(zhì)體的形成，但有可能在這種條件下菌體去壁后，菌體內(nèi)的其他成分或結(jié)構(gòu)也遭到破壞，抑制了原生質(zhì)體的再生。相比而言9號原生質(zhì)體的形成率與再生率都比較高，其酶解條件為：原生質(zhì)體穩(wěn)定液選擇高滲溶液Ⅲ、酶質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、酶解溫度為36 ℃、酶解時間為30 min。與正交試驗得到的最佳酶解條件相比，原生質(zhì)體穩(wěn)定液不同，酶解時間縮短。通過正交極差分析，原生質(zhì)體穩(wěn)定液和酶解時間不是影響原生質(zhì)體形成的主要顯著因素，因此，綜合考慮得出菌株L. b的最優(yōu)原生質(zhì)體制備條件為：原生質(zhì)體穩(wěn)定液選擇高滲溶液Ⅲ、酶質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、酶解溫度為36 ℃、酶解時間為30 min。這時原生質(zhì)體的形成率為（89.02±2.31）%，再生率為（4.62±0.22）%。

2.2.3保加利亞乳桿菌L. b原生質(zhì)體形態(tài)

圖2 菌株L. b（A）與其原生質(zhì)體（B）形態(tài)圖（×1 000）Fig.2 Micrograph of L. bulgaricus （A） and its protoplast （B） （ 1 000）

菌株L. b原生質(zhì)體制備后的菌體形態(tài)如圖2，菌株L. b為桿狀，原生質(zhì)體呈圓形或橢圓形且染色較淺。

2.3保加利亞乳桿菌L. b的原生質(zhì)體滅活

在細胞融合之前對菌株L. b的原生質(zhì)體進行滅活，原生質(zhì)體滅活的方式通常有紫外線照射和高溫處理［23］。高溫處理對遺傳物質(zhì)的傷害比較小，破壞作用主要在細胞質(zhì)中的蛋白和核糖體，原生質(zhì)體中的染色體仍具有復(fù)制、重組功能，可以起到遺傳物質(zhì)的載體作用［24］。在不同溫度條件下菌株L. b原生質(zhì)體的滅活率隨時間變化的關(guān)系見圖3。

圖3 菌株L. b原生質(zhì)體滅活溫度和時間對滅活率的影響Fig.3 Effect of inactivation time and temperature on inactivation rate of L. bulgaricus protoplasts

由圖3可知，滅活40 min后菌株L. b的原生質(zhì)體滅活率都可達到98%以上，一般認為DNA的變性溫度為80 ℃，考慮到溫度越高，對遺傳物質(zhì)的破壞越大，所以采用60 ℃、50 min作為保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體的滅活條件。此條件下，原生質(zhì)體的滅活率為（98.64±0.52）%。

2.4嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t的原生質(zhì)體制備及再生

2.4.1最佳原生質(zhì)體制備條件的確定

通過正交試驗確定菌株S. t的最佳酶解條件，每個試驗號重復(fù)3 次，其正交試驗方案及結(jié)果見表2。

表2　菌株S. t原生質(zhì)體制備條件的正交試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results on protoplast formation of S. thermophilus

由表2可知，影響菌株S. t原生質(zhì)體形成的主要因素為酶解溫度和原生質(zhì)體穩(wěn)定液，溶菌酶的質(zhì)量濃度影響不是很大，酶解時間幾乎沒有影響。從正交表得出的最佳酶解條件為：A2B1C3D1，即原生質(zhì)體穩(wěn)定液選擇高滲溶液Ⅱ、酶質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL、酶解溫度為42 ℃、酶解時間為30 min，在此條件下進行菌株S. t的原生質(zhì)體制備，原生質(zhì)體形成率為（99.15±0.23）%。菌株S. t在溫度比較高的情況下，較低的酶質(zhì)量濃度、較短的酶解時間即可完成原生質(zhì)體的形成。其中在高滲溶液Ⅱ中原生質(zhì)體的形成率比較高的原因還不是很清楚。

2.4.2原生質(zhì)體形成率與再生率的關(guān)系

同時由表2可知，正交試驗中的3號原生質(zhì)體的形成率比較高，而再生率低。在酶解時3號的酶解條件為：原生質(zhì)體穩(wěn)定液選擇高滲溶液Ⅰ、酶質(zhì)量濃度1.0 mg/mL、酶解溫度42 ℃、酶解時間50 min，不利于原生質(zhì)體的再生。比較而言，4、5、6號原生質(zhì)體形成率、再生率都比較高，其共同點為以高滲溶液Ⅱ作為原生質(zhì)體穩(wěn)定液，因而可以認為高滲溶液Ⅱ有益于嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質(zhì)體的形成與再生。綜合考慮確定菌株S. t原生質(zhì)體制備的最優(yōu)條件為：原生質(zhì)體穩(wěn)定液選擇高滲溶液Ⅱ、酶質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL、酶解溫度為42 ℃、酶解時間為30 min。這時原生質(zhì)體的形成率為（99.15±0.23）%，再生率為（5.79±0.17）%。

2.4.3嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t原生質(zhì)體形態(tài)

圖4 菌株S. t（A）與其原生質(zhì)體（B）形態(tài)圖（×1 000）Fig.4 Micrograph of bacteriophage-resistant S. thermophiles and its protoplast （B） （ 1 000）

菌株S. t原生質(zhì)體制備后的菌體形態(tài)如圖4所示，菌株S. t為鏈狀球菌，原生質(zhì)體呈圓形且染色較淺。

2.5保加利亞乳桿菌L. b與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t原生質(zhì)體融合條件的確定

在原生質(zhì)體制備時，菌株L. b選用高滲溶液Ⅲ，菌株S. t選用高滲溶液Ⅱ作為原生質(zhì)體穩(wěn)定液。因為原生質(zhì)體穩(wěn)定液對菌株L. b原生質(zhì)體的制備與再生影響不大，所以融合時采用高滲溶液Ⅱ作為共同的原生質(zhì)體穩(wěn)定液。溫度及融合時間對融合率的影響見圖5。

圖5　融合溫度和時間對原生質(zhì)體融合率的影響Fig.5　Effects of temperature and time on protoplast fusion rate

由圖5可知，溫度高或低都不利于原生質(zhì)體的融合。溫度高的情況下，雖有利于菌體的流動性及通透性，但在高溫時，溫度及外界環(huán)境中PEG等對原生質(zhì)體的損傷也加劇，不利于融合子的再生；溫度低的情況下，菌體的活性及融合環(huán)境的流動性較弱，不利于菌體的接觸與融合。從圖中可知融合時間也不宜太長，隨著融合時間的增加，融合率逐漸降低，這可能是PEG處理時間過長，會對原生質(zhì)體造成一定的毒性，從而導(dǎo)致其失活［24］。最佳融合條件為：40 ℃，融合2 min，此時融合率為（1.85±0.12）×10-6。

2.6融合子的檢出及穩(wěn)定性檢測

融合后MRS再生培養(yǎng)基上長出20 株再生菌落，經(jīng)噬菌體檢測后挑出12 株融合子，對12 株融合子進行傳代穩(wěn)定性實驗，其中3 株傳15 代后仍具有噬菌體抗性且在MRS培養(yǎng)基上生長良好，3 株融合子傳代后在MRS培養(yǎng)基上的生長情況如表3所示，以Rh6在MRS培養(yǎng)基上生長最好，其菌體形態(tài)如圖6所示。與出發(fā)菌株相比，融合子Rh6呈橢圓形近似短桿，而菌株L. b為長桿狀，菌株S. t為圓形。

表3　融合子在MRS培養(yǎng)基上的生長情況Table 3 Growth status of fusants in MRS culture medium 109 CFU

圖6　融合前后菌體形態(tài)（×1 0000）Fig.6　Micrograph of L. bulgaricus and S. thermophilus as well as their fusants?。ā?1　000000）

由表3、圖6可知，融合子Rh6與噬菌體共同傳代15 代后仍具有噬菌體抗性，在牛乳培養(yǎng)基中可正常生長、凝乳，將傳15 代后的融合子涂布于MRS培養(yǎng)基上仍生長良好，菌體形態(tài)與剛篩選到時一致且異于出發(fā)菌株，因此可認為篩選到的融合子Rh6具有遺傳穩(wěn)定性。

2.7融合子的發(fā)酵特性

2.7.1融合子Rh6牛乳發(fā)酵過程中的活菌數(shù)及pH值

圖7　發(fā)酵過程中的活菌數(shù)及ppHH值Fig.7　Number of viable bacteria and pH during fermentation

由圖7可知，融合子Rh6在牛乳發(fā)酵過程中的活菌數(shù)和pH值與通常酸奶發(fā)酵過程中使用兩種菌的差異不大，融合子的發(fā)酵條件比較好控制且不存在如何在發(fā)酵中控制兩種菌比例的問題。

2.7.2融合子Rh6的發(fā)酵結(jié)果及感官風(fēng)味評價

對融合子Rh6進行牛乳發(fā)酵實驗。3%接種量，42 ℃酸奶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果如表4所示，發(fā)酵后的酸奶細膩黏稠，乳香濃郁，酸甜適中，稍有乳清析出。從理化指標及感官風(fēng)味評價，融合子適合于酸奶生產(chǎn)。

表4　融合子Rh6牛乳發(fā)酵結(jié)果Table 4　Fermentation performance of fusion Rh6

3　結(jié) 論

保加利亞乳桿菌L. b在原生質(zhì)體制備時酶質(zhì)量濃度的影響比較大，這與菌株L. b細胞壁比較致密且對溶菌酶不是很敏感［19］有關(guān)，在酶解過程中需要較高的酶質(zhì)量濃度。在較高酶質(zhì)量濃度的情況下，隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體的形成率雖可提高，但再生率會有所下降。對嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t而言，比較高的溫度有益于原生質(zhì)體的形成，在以高滲溶液Ⅱ為原生質(zhì)體穩(wěn)定液時，菌株S. t原生質(zhì)體的形成率和再生率最高，這可能與菌株S. t自身的細胞及細胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體原因尚不明確。

關(guān)于保加利亞乳桿菌L. b與嗜熱鏈球菌S. t原生質(zhì)體的融合曾獻春等［16，25］曾有報道，本實驗通過單親滅活及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株S. t在MRS培養(yǎng)基上不生長的特性篩選融合子，避免了篩選的盲目性。同時融合子未引入外源基因且集合了雙親的優(yōu)良性狀，篩選到的融合子沒有安全隱患、具有抗噬菌體功能、在進行酸奶發(fā)酵時發(fā)酵特性優(yōu)良，可以用于酸奶生產(chǎn)。

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Protoplast Formation and Fusion between Lactobacillus bulgaricus and Bacteriophage-Resistant Mutant of Streptococcus thermophilus

WANG Muhua1， PAN Peiping1， ZHAO Yuming1，2， SU Binnan1， CAI Yinghui1， LI Haitao1，2
（1. Biology Institute of Shanxi， Taiyuan030006， China； 2. Shanxi Veal Biological Dairy Products Co. Ltd.， Taiyuan030006， China）

Primary factors affecting protoplast formation and regeneration of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were investigated using orthogonal array design to obtain fusants with bacteriophage resistance and superior fermentation performance. The results showed that the optimal preparation conditions for L. bulgaricus protoplasts were achieved by treatment with 1.0 mg/mL lysozyme for 30 min at 36 ℃ in the presence of hypertonic solution with phosphate buffer and mannitol. Under these conditions， the protoplast formation and regeneration rates reached（89.02 ± 2.31）% and （4.62 ± 0.22）%， respectively. The protoplast formation and regeneration rates of bacteriophage-resistant S. thermophilus were up to （99.15 ± 0.23）% and （5.79 ± 0.17）% after treatment with 0.1 mg/mL lysozyme for 30 min in the presence of hypertonic solution with Tris-HCl buffer and sucrose. The fusion rate of protoplasts between L. bulgaricus and S. thermophilus reached （1.85 ± 0.12） × 10-6after infusion for 2 min at 40 ℃ in the presence of 400 g/L PEG6000，0.01 mol/L CaCl2and 0.02 mol/L MgCl2. The performance of the fusant is stable and it is applicable to yoghurt production.

Lactobacillus bulgaricus； bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus； protoplast formation；protoplast fusion

Q813.2；Q939.117

A

1002-6630（2015）23-0189-06

10.7506/spkx1002-6630-201523035

2015-01-04

山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計劃項目（20120311030）

王慕華（1975—），女，副研究員，碩士，研究方向為工業(yè)微生物，乳品發(fā)酵。E-mail：wang_muhua@126.com