曹春廷，孫叢龍，白衛(wèi)濱，*，孫建霞，李國強，歐仕益，楊　勇*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014；2.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；3.廣東工業(yè)大學輕工化工 學院，廣東 廣州 510006）

柘樹果實的抗乳腺癌活性部分的提取、分離及結構鑒定

曹春廷1，2，孫叢龍2，白衛(wèi)濱2，*，孫建霞3，李國強2，歐仕益2，楊勇1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014；2.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；3.廣東工業(yè)大學輕工化工 學院，廣東 廣州 510006）

為了得到柘樹果實中具有抗乳腺癌活性的化合物，以人乳腺癌細胞MDA-MB-231和人乳腺癌細胞MCF-7為細胞模型，通過噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法評價柘樹果實石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、以及正丁醇浸膏粗提取物部位的功能，實驗發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位具有明顯的抑制乳腺癌細胞的活性，其對乳腺癌細胞MDA-M B-231和MCF-7的IC50分別為：75.4 μg/mL和66.8 μg/mL。采用Sephad ex LH-20柱層析和硅膠柱層析對乙酸乙酯部位進行分離，采用單晶X衍射對得到的化合物進行結構鑒定，得到2 種晶體主成分，分別為4'-O-甲基-吡喃異黃酮、吡喃異黃酮。采用MTT方法對獲得的2 種單體進行抗乳腺癌活性研究，發(fā)現(xiàn)吡喃異黃酮對乳腺癌細胞MCF-7的生長抑制率達到56.7%。結果表明，柘樹果實乙酸乙酯部位含有抗乳腺癌成分，且分離得到2 種類異黃酮化合物，其中吡喃異黃酮體現(xiàn)出一定的抗乳腺癌活性。

柘樹果實；分離提??；抗乳腺癌；結構鑒定

柘樹（Cudrania tricuspidata）為?？疲∕oraceae）柘屬（Cudrania）植物，又名柘木、柘桑、刺桑、奴柘等，全世界存在約有6 種柘屬植物，主要分布在亞洲和大洋洲。在我國，柘屬植物資源非常豐富，存在5 個品種和2 個變種［1］，主要分布在我國華南、西南、華北（除內蒙古外）各 省。柘樹具有很大的藥用價值，前人已經(jīng)從柘 樹中分離純化出多種化合物，如黃酮、異黃酮、氧雜蒽酮、生物堿、糖類等［1-4］，對其活性進行研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、保護肝臟［7］、抗炎鎮(zhèn)痛［8-9］、保護肝臟［10］和抗結核［11］等作用，而這些生物活性主要是柘樹中黃酮類化合物的作用［12-14］。Choi等［15］研究證明了柘樹中含有抗乳腺癌的化學成分，從柘樹根部分離得到的吉利柘樹素A對MCF-7乳腺癌細胞的增殖有抑制作用，IC50為20.0 μg/mL。但上述研究主要集中在柘樹的干燥根、根皮樹皮以及柘木，而對柘樹果實的研究相對較少。研究表明，柘果也具有很多活性物質［16-19］，如山柰、蘆丁、槲皮素等，但由于柘樹樹齡超過50 年屬于國家一級保護樹種，禁止砍伐，而柘果由于一年一結果，并且同柘樹根、柘樹莖皮以及柘樹莖研究利用相比，對其功效成分分析及營養(yǎng)作用知之甚少，對其開發(fā)遠遠不夠，因此急需開展對柘果的研究。

截止目前，尚未發(fā)現(xiàn)柘樹果實中抗乳腺癌的化學成分研究報道。因此，本實驗對柘樹果實的抗乳腺癌化學成分開展研究，以期為其在抗乳腺癌方面的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實驗所用原料柘樹新鮮果實，采于山東省煙臺市。

人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231細胞 暨南大學醫(yī)藥中心；MCF-7細胞CCTCC、MDA-MB-231細胞CCTCC、1640培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素 美國Gibco公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Amresco公司；水溶性VE（Trolox） 美國Sigma公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

柱層析用硅膠（100～200、200～300 目）、GF254硅膠薄層預制板 青島海洋化工廠；Sephadex LH-20丙基葡聚糖凝膠 GE Healthcare（中國）有限公司；薄層制備板（10 cm×10 cm） 煙臺化學工業(yè)研究所；RE-52旋轉蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司；酶標儀美國Thermo Fisher Scientifi c公司；超凈工作臺 蘇州凈化設備公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 美國Thermo Forma有限責任公司；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；三用紫外分析儀 上海驥輝科學分析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1柘樹果實粗提物獲得

稱取新鮮柘樹果實270 g，勻漿機打碎后，置于提取罐中，快速加入1 000 mL甲醇溶劑，常溫下靜置浸提，24 h后收集浸提液，按上述操作，重復多次，合并浸提液。將獲得的全部浸提液，1 500 r/min離心4 h，去掉浸提液中的懸浮物，取上清，在60 ℃條件下進行旋轉蒸發(fā)，得浸膏（約200 g）。將得到的總浸膏用適量水混懸于燒杯中，依次在浸提罐中用純石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液，在80 ℃條件下進行旋轉蒸發(fā)，得石油醚（petroleum ether，PE）浸膏31 g，乙酸乙酯（ethyl acetate，AE）浸膏120 g，以及正丁醇（n-butyl alcohol，n-BuOH）浸膏26 g。

1.3.2柘樹果實抗乳腺癌有效部位確定

稱取相同量獲得的PE、AE，以及n-BuOH溶于二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）配制為母液，進行MTT實驗［20］，評價三者的抑癌活性。其具體實驗步驟為：收集生長對數(shù)期的細胞，通過計數(shù)來調整細胞懸液濃度，然后在96 孔板上鋪板，每孔加入100 μL，使待測細胞調密度4 000/孔，且96 孔板的邊緣孔用無菌磷酸緩沖鹽溶液填充；含體積分數(shù)5%的CO2，37 ℃孵育，至細胞開始在孔底貼壁生長（96 孔平底板），加入質量濃 度梯度（0、10、20、40、80 μg/mL）的粗提物，原則上細胞貼壁后即可加藥；用移液槍吸掉培養(yǎng)基，再加入含藥培養(yǎng)基。每個質量濃度設置5 個復孔，同時設置空白組（加入培養(yǎng)基、MTT、DMSO）和對照組（加入細胞、培養(yǎng)液、MTT、DMSO，不加藥物）。含體積分數(shù)5%的CO2，37 ℃孵育24 h；每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內混合溶液，終止培養(yǎng)；然后，每孔加入100 μL DMSO溶液，在酶聯(lián)免疫檢測儀上振搖5 min，使生成的甲瓚充分溶解，然后在波長490 nm處測量每個孔的光密度（OD）值。按下式計算生長抑制率。

式中：OD0為空白組的光密度值；OD1為對照組的光密度值；OD為實驗組的光密度值。

1.3.3柘樹果實有效成分分離、結構鑒定

活性部位經(jīng)硅膠柱層析。稱量200～300 目硅膠，30 倍于上樣量，采用干法上樣法，選用石油醚-乙酸乙酯容積系統(tǒng)，按照比例（100∶3～0∶100）進行梯度洗脫，每50 mL收集一個餾分。在濃硫酸香草醛作為顯色劑條件下，用薄層層析分析合并餾分，再用Sephadex LH-20柱色譜進行分離純化，用的凝膠柱為25 mm×1 200 mm大小，流動相為氯仿和甲醇，其體積比為1∶1，其余步驟與硅膠柱層析方法一致。分離得到晶體化合物采用單晶衍射進行結構鑒定。

1.3.4類異黃酮物質對乳腺癌細胞的抑制作用

兩種類異黃酮化合物用DMSO溶解，母液濃度為50 mmol/L。MTT實驗步驟及結果處理同1.3.2節(jié)。

2　結果與分析

2.1柘樹果實對乳腺癌細胞MDA-MB-231抑制效果

圖1　3 種粗提物對MDA-MB-231細胞生長抑制率比較Fig.1　Inhibitory rates of three fractions against the growth of MDA-MB-231 cells

如圖1所示，與PE和n-BuOH部位相比較，AE部位抑制效果更明顯，IC50為75.4 μg/mL，與空白組比較，有顯著性差異（P＜0.05），表明柘樹果實AE部分是含有抗乳腺癌成分主要活性部位。

2.2柘樹果實對乳腺癌細胞MCF-7抑制效果

圖2　3 種粗提物對MCF-7細胞增殖抑制率比較Fig.2　Inhibitory rates of three fractions against the growth of MCF-7 cells

如圖2所示，與PE和n-BuOH部位相比較，AE部位表現(xiàn)出了明顯的抑癌活性，IC50為66.8 μg/mL，與空白組比較，有顯著性差異（P＜0.05），表明柘樹果實AE部分是含有抗乳腺癌成分主要活性部位。與乳腺癌細胞MDA-MB-231相比，柘樹果實對乳腺癌細胞MCF-7作用更強。

2.3柘樹果實分離純化化合物晶體結構

硅膠柱層析結束，選擇濃硫酸香草醛作為顯色劑，經(jīng)薄層層析分析合并，得到多個總餾分。再將總餾分經(jīng)過Sephadex LH-20柱層析純化，運用單晶衍射的方法，對得到量大的2 個晶體化合物：4'-O-甲基-吡喃異黃酮（45 mg）、吡喃異黃酮（35 mg）并進行結構鑒定。

化合物4'-O-甲基-吡喃異黃酮：淡黃色針晶，化合物吡喃異黃酮：黃色方晶。2 個晶體的化學結構見圖3，數(shù)據(jù)見表1。

圖3　4 3 4'-O-甲基-吡喃異黃酮（a）和吡喃異黃酮（b）的化學結構Fig.3　Chemical structures of 4'-O-methylalpinumfisoflavone （a） and alpinumisoflavone （b）

表 1 4'-O-甲基-吡喃異黃酮和吡喃異黃酮晶體數(shù)據(jù)Table1　Crystal structural data of 4 -methylalpinumfisoflavone and alpinumisoflavone

2.4類異黃酮物質對乳腺癌細胞的抑制作用

圖1、2表明，柘樹果實對乳腺癌細胞MCF-7抑制作用更明顯，因此選擇MCF-7細胞作為研究對象，進一步研究獲得的兩種類異黃酮晶體4'-O-甲基-吡喃異黃酮和吡喃異黃酮對乳腺癌細胞的生長起抑制作用。MTT實驗所用的類異黃酮物質的劑量為0、10、20、40、80 μmol/L，結果如表2。在80 μmol/L濃度作用下，4'-O-甲基-吡喃異黃酮和吡喃異黃酮兩種類異黃酮物質對MCF-7細胞生長抑制率分別為12.9%和56.7%，吡喃異黃酮表現(xiàn)出一定的抗乳腺癌活性。

表 2 4'-O-甲基-吡喃異黃酮對MCF-7細胞生長抑制率Table2　Inhibitory rates of 4' -methylalpinumisoflavone against the growth of MCF-7 cells

3　討 論

本實驗對柘果在乳腺癌方面作用進行探討，發(fā)現(xiàn)柘樹果實具有抗乳腺癌作用，對不同株系的乳腺癌細胞作用效果不同，其MDA-MB-231和MCF-7的IC50分別為：75.4 μg/mL和66.8 μg/mL，且乙酸乙酯部位是最有效部位。并進一步分離純化得到2 種類 異黃酮類晶體化合物吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮。研究吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮對乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用，發(fā)現(xiàn)吡喃異黃酮對乳腺癌細胞MCF-7具有一定的抗乳腺癌活性。有研究發(fā)現(xiàn)吡喃異黃酮和4'-O-甲基- 吡喃異黃酮具有氧化酶抑制活性，Han Xianghua等［16］研究發(fā)現(xiàn)柘果中的4'-O-甲基-吡喃異黃酮、吡喃異黃酮對鼠大腦單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）抑制作用，對MAO的IC50值分別為23.9 μmol/L和25.8 μmol/L。證明本實驗分離出的兩種類異黃酮物質具有一定的生物活性。

異黃酮類物質具有預防乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和骨質疏松等疾?。?1］，有很強的生物效應。已有的很多科學研究表明異黃酮類化合物具有抗腫瘤的作用［22-24］。目前學術界公認的異黃酮抗腫瘤作用機制有：1）通過直接清除自由基或提高抗氧化物酶的活性來清除自由基，進而誘導腫瘤細胞凋亡；2）通過影響致癌物質的代謝酶的活性等來抑制腫瘤的發(fā)生；3）異黃酮類化合物能夠顯著地提高腫瘤細胞對某些化療藥物的敏感性［25］。

吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮比傳統(tǒng)異黃酮母核結構多一個聯(lián)環(huán)，并且二者結構上只存在一個取代基的差異，但在抗乳腺癌活性研究中表現(xiàn)出不同的抑制效果，證明結構對功能的影響。下一步擬研究吡喃異黃酮和4'-O-甲基-吡喃異黃酮結構、生物活性及其作用機制，進一步為柘樹果實營養(yǎng)功能的開發(fā)提供科學依據(jù)。

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Extraction， Separation and Structure Identification of Anti-breast Cancer Compounds from Cudrania tricuspidata Fruits

CAO Chunting1，2， SUN Conglong2， BAI Weibin2，*， SUN Jianxia3， LI Guoqiang2， OU Shiyi2， YANG Yong1，*
（1. College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China；2. Department of Food Science and Engineering， Jinan University， Guangzhou 510632， China；3. Faculty of Chemical Engineering and Light Ind ustry， Guangdong University of Technology， Guangzhou 510006， China）

The purpose of the present work was to obtain anti-breast cancer compounds from Cudrania tricuspidata fruits. The methanol extract of Cudrania tricuspidata fruits was sequentially extracted with petroleum ether （PE）， ethyl acetate （AE） and n-butyl alcohol （n-BuOH） to obtain PE， AE and n-BuOH fractions. MTT assay was used to evaluate the anti-breast cancer activity of the methanol extract and its three fractions against breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MCF-7. The results showed that the AE fraction had significant inhibitory activity on MDA-MB-231 and MCF-7 cells with half maximal inhibitory concentrations （IC50） of 75.4 and 66.8 μg/mL， respectively. Then， the AE fraction was further separated by silica gel column chromatography a nd Sephadex LH-20 column chromatography assay. The structures of crystals obtained from this separation process were identifi ed using single-crystal X diffraction. Two major crystal components were identifi ed including 4'-O-methylalpinumisofl avone and alpinumisofl avone. As evaluated by MTT assay， the inhibitory rate of alpinumisofl avone against MCF-7 cell growth was 56.7%. Therefore， t he AE fraction from Cudrania tricuspidata fru its containing isofl avones and alpinumisofl avones has pot ent anti-breast cancer activity depending on the presence of alpinumisofl avone.

Cudrania tricuspidata （Carr.） Bur. fruits； separation and extraction； anti-breast cancer； structural identifi cation

R151

A

1002-6630（2015）13-048-04

10.7506/spkx1002-6630-201513010

2014-12-27

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD36B04）

曹春廷（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養(yǎng)。E-mail：caochunting1@163.com

白衛(wèi)濱（1978—），男，副研究員，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與毒理安全性評價。E-mail：baiweibin@163.com楊勇（1969—），男，教授，博士，研究方向為肉品科學與技術。E-mail：yangyong676@163.com